前言

腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）是一個(gè)龐大而重要的免疫調(diào)節(jié)家族，為許多免疫效應(yīng)細(xì)胞提供關(guān)鍵的共刺激信號(hào)。每一個(gè)共刺激TNFRSF成員在不同類型的細(xì)胞和免疫反應(yīng)的不同階段都有不同的表達(dá)譜和獨(dú)特的功能影響。利用TNFRSF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行腫瘤免疫治療已成為一個(gè)重要的領(lǐng)域。

嵌合抗原受體（CAR）－T細(xì)胞治療可能是過(guò)去十年免疫治療中最重大的突破，隨著CAR－T細(xì)胞技術(shù)越來(lái)越成熟，CAR結(jié)構(gòu)的組成，特別是細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域也在不斷進(jìn)化。第一代（G1）CAR－T細(xì)胞結(jié)構(gòu)包含腫瘤相關(guān)抗原的高親和力單鏈抗體（scFv）、跨膜結(jié)構(gòu)域和唯一的細(xì)胞內(nèi)TCR－ζ或FcR－γ結(jié)構(gòu)域。G1 的臨床益處有限，主要是由于其增殖能力低和體內(nèi)細(xì)胞毒性有限。為了克服這一缺點(diǎn)，第二代（G2）CAR結(jié)構(gòu)配備了額外的細(xì)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域，最顯著的是CD28或TNFRSF成員4－1BB。這些G2 CARs被證明是非常有效的，幾種CAR－T產(chǎn)品在治療血液瘤方面獲得了監(jiān)管部門(mén)的批準(zhǔn)。

第三代（G3）CAR－T結(jié)構(gòu)包含了共刺激結(jié)構(gòu)域的組合，而第四代（G4）和第五代（G5）CAR－T細(xì)胞包含額外的共刺激結(jié)構(gòu)域，在抗原識(shí)別時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞因子（例如IL－12），或包含某些細(xì)胞因子受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（例如，截短的IL－2受體β鏈和STAT3結(jié)合部分）。在此，我們來(lái)一起回顧了TNFRSF的細(xì)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域在增強(qiáng)和調(diào)節(jié)CAR－T細(xì)胞活性方面的應(yīng)用。

4－1BB的共刺激結(jié)構(gòu)域

4－1BB是一種關(guān)鍵的共刺激受體，在TCR－MHC相互作用時(shí)的T細(xì)胞上快速上調(diào)。其配體4－1BBL在抗原呈遞細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞）上表達(dá)。4－1BBL與4－1BB的結(jié)合導(dǎo)致TRAF1、TRAF2和TRAF3向4－1BB的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域募集。隨后，形成了包含多種蛋白質(zhì)（包括激酶和泛素連接酶）的4－1BB信號(hào)復(fù)合體，并最終啟動(dòng)關(guān)鍵信號(hào)通路，如NF－kB和PI3K－AKT。最終，4－1BB信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖、促炎細(xì)胞因子的分泌以及效應(yīng)和記憶T細(xì)胞（Tm）的擴(kuò)增。

4－1BB的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)結(jié)構(gòu)域是CAR－T細(xì)胞結(jié)構(gòu)中應(yīng)用最早、探索最多的TNFRSF成員。與CD28 CAR－T細(xì)胞相比，4－1BB共刺激產(chǎn)生具有明顯代謝特征的CAR－T細(xì)胞，如T細(xì)胞表面GLUT1表達(dá)減少和線粒體呼吸增加。這些差異也反映在CAR－T細(xì)胞表型和功能上。例如，CD19靶向CAR－T細(xì)胞中的4－1BB共刺激在小鼠模型中產(chǎn)生了更有效的B－ALL清除，并且4－1BB CAR－T比CD28共刺激的CAR－T細(xì)胞持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。

目前，共有三種使用了4－1BB的CAR－T細(xì)胞產(chǎn)品，即Tisagenelecluel（Kymriah）、Liscabatagene－Maraluel（BREYANZI）和Idecabatgene－Vicluel（ABECMA），已獲得FDA批準(zhǔn)。Tisagenlecleucel是一種CD19靶向G2 CAR－T細(xì)胞，在93例DLBCL患者進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中，其產(chǎn)生了強(qiáng)大的藥效（52％，ORR；40％，CR；12％，PR）。此外，觀察到強(qiáng)烈但可控的3級(jí)或4級(jí)副作用，如89．7％的患者出現(xiàn)可逆性細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS），9名患者出現(xiàn)可逆性神經(jīng)精神事件（31％）。

Liscabatagene－Maraluel是另一種CD19靶向的G2 CAR－T細(xì)胞產(chǎn)品，含有4－1BB結(jié)構(gòu)域，額外表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的截?cái)喟姹尽＿@種設(shè)計(jì)考慮到安全性，在需要時(shí)，可以使用Cetuximab清除CAR－T細(xì)胞。在對(duì)256例復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤患者進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中，其ORR和CR分別為73％ 和53％。

第三種4－1BB CAR－T細(xì)胞產(chǎn)品IdecabtageneVicluel是FDA批準(zhǔn)的第一種治療多發(fā)性骨髓瘤的CAR－T細(xì)胞療法，其靶向多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上表達(dá)的B細(xì)胞成熟抗原（BCMA）。在難治性和復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤（rrMM）患者中的II期臨床試驗(yàn)中，其ORR為73％，CR達(dá)到33％，26％的患者達(dá)到了最小殘留病灶（MRD）陰性狀態(tài)。此外，在另一項(xiàng)3期研究（NCT03651128）中，與標(biāo)準(zhǔn)治療相比，Idecabtagene顯著改善了ORR（76．4％ vs 32．2％）、PFS（11．6vs 3．5個(gè)月）和OS（20．2 vs 14．7個(gè)月）。

為了將T細(xì)胞效應(yīng)器功能與T細(xì)胞記憶誘導(dǎo)結(jié)合起來(lái)，并實(shí)現(xiàn)更持久的臨床反應(yīng)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出包含CD28和4－1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的G3CAR－T結(jié)構(gòu)。與G2 CAR－T細(xì)胞相比，G3 CAR－T細(xì)胞的治療觸發(fā)了重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子（如LAT、ZAP－70、SYK和ERK）的更多磷酸化。因此，G3 CAR－T細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL－2，具有更高的增殖能力和更好的體內(nèi)持久性。

幾項(xiàng)研究探索了4－1BB G3 CAR－T細(xì)胞的臨床應(yīng)用，在四名復(fù)發(fā)性惰性B細(xì)胞或套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）患者中進(jìn)行了一項(xiàng)小型試驗(yàn)，以測(cè)試針對(duì)靶向CD20的CD28和4－1BB G3CAR－T細(xì)胞的安全性，該試驗(yàn)證明其總體上安全且耐受性良好。值得注意的是，其中2名患者CR，并且在12個(gè)月和24個(gè)月內(nèi)沒(méi)有進(jìn)展，即使在輸注后1年，血液中也能檢測(cè)到CAR－T細(xì)胞。此外，針對(duì)其他靶點(diǎn)的G3 CAR－T細(xì)胞也進(jìn)行了評(píng)估。例如，前列腺癌靶抗原（PSMA）G3 CD28和4－1BB CAR－T細(xì)胞也顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性。

總之，在CAR－T細(xì)胞結(jié)構(gòu)中加入4－1BB共刺激結(jié)構(gòu)域可改善CAR－T細(xì)胞的體內(nèi)持久性，增強(qiáng)記憶形成，并降低耗竭標(biāo)記物的表達(dá)。在結(jié)合4－1BB和CD28共刺激的G3 CAR－T細(xì)胞構(gòu)建中，與G2 CAR－T細(xì)胞相比，獲得了更高的增殖能力和更好的體內(nèi)持久性。并且迄今為止發(fā)現(xiàn)CD28和4－1BB G3 CAR－T細(xì)胞安全且耐受性良好。然而，考慮到CAR－T細(xì)胞應(yīng)用中的某些共刺激結(jié)構(gòu)域用于治療特定類型的癌癥，因此，在得出明確結(jié)論之前應(yīng)小心謹(jǐn)慎。

OX40的共刺激結(jié)構(gòu)域

另一個(gè)被探索作為CAR－T細(xì)胞共刺激劑的TNFRSF成員是OX40。OX40僅在MHC－TCR參與時(shí)在T細(xì)胞上上調(diào)，OX40信號(hào)增加T細(xì)胞的持久性并誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞（Tm）的形成。OX40信號(hào)還觸發(fā)克隆擴(kuò)增并上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl－2、Bcl－xL和Bfl－1，從而促進(jìn)活化T細(xì)胞的存活。

OX40和4－1BB在功能上有許多相似之處，但它們?cè)谡{(diào)節(jié)CD4＋和CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)方面存在明顯的活性差異。OX40和4－1BB實(shí)際上在腺病毒感染時(shí)調(diào)節(jié)CD8＋ T細(xì)胞克隆擴(kuò)增方面具有相反的作用，OX40缺陷的CD8＋T細(xì)胞顯示CD8＋T細(xì)胞擴(kuò)增減少，而4－1BB缺陷的CD8＋T細(xì)胞實(shí)際上表現(xiàn)出高反應(yīng)性，導(dǎo)致CD8＋T細(xì)胞數(shù)量增加。此外，T細(xì)胞分化為功能性效應(yīng)細(xì)胞需要OX40，而4－1BB導(dǎo)致啟動(dòng)早期分化水平降低。

與CD28 G2 CAR－T相比，OX40G2 CAR－T細(xì)胞產(chǎn)生更多IFN－γ、同等水平的IL－2和類似的CAR－T細(xì)胞增殖反應(yīng)。更重要的是，OX40 G2 CAR－T細(xì)胞產(chǎn)生的IL－10水平顯著降低。相應(yīng)地，與CD28 G2 CAR－T細(xì)胞相比，針對(duì)癌胚抗原（CEA）的G3 CAR－T細(xì)胞中CD28與OX40的聯(lián)合刺激降低了IL－10的水平，并阻止了CAR－T細(xì)胞的自動(dòng)抑制。此外，CD28／OX40共刺激使CAR－T細(xì)胞在重復(fù)抗原結(jié)合時(shí)免于激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

許多早期證據(jù)表明OX40是一種很有希望用于CAR－T細(xì)胞的共刺激結(jié)構(gòu)域。它能防止自身抑制，拯救活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，以及優(yōu)越的細(xì)胞毒性活性。目前，靶向雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GD2）陽(yáng)性實(shí)體癌（如黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤和一些其他肉瘤）的CD28／OX40CAR－T細(xì)胞是正在治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的臨床試驗(yàn)（NCT02107963）中進(jìn)行評(píng)估。

CD27的共刺激結(jié)構(gòu)域

CD27的表達(dá)存在于CD4＋和CD8＋T細(xì)胞、NK細(xì)胞和啟動(dòng)的B細(xì)胞上。CD27的配體CD70在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)，包括DC和巨噬細(xì)胞。在激活T細(xì)胞上的CD27后，下游信號(hào)通過(guò)NF－κB誘導(dǎo)激活，導(dǎo)致T細(xì)胞活化、分化和克隆擴(kuò)增。

與G1 CAR T細(xì)胞相比，在SKOV3人卵巢癌細(xì)胞－小鼠模型中，CD27 G2 CAR－T細(xì)胞具有增強(qiáng)的抗原刺激效應(yīng)器功能、上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)、增強(qiáng)的體內(nèi)持久性和增強(qiáng)的腫瘤消退。在該模型中，CD27 G2 CAR－T細(xì)胞和4－1BB或CD28 G2 CAR－T細(xì)胞之間未觀察到差異。然而，與CD28介導(dǎo)的共刺激相比，CD27共刺激增強(qiáng)了CAR－T細(xì)胞的持久性。

臨床上，在34例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中，以GD2為靶向的CD27／CD28 CAR－T細(xì)胞治療產(chǎn)生15％的PR和38％的SD，一年生存率為74％。在另一項(xiàng)最近關(guān)于CD27／CD28 CAR－T細(xì)胞的臨床研究中，CLL1靶向CAR－T細(xì)胞在AML患者中被證明是安全的。令人印象深刻的是，在這項(xiàng)研究的四名患者有3名顯示CR，MRD陰性，可以繼續(xù)進(jìn)行造血干細(xì)胞移植（HSCT）。這些患者的副作用僅限于1至2級(jí)CRS。

值得注意的是，激活CD27也可誘導(dǎo)CD8＋T細(xì)胞的終末分化、耗竭和凋亡。事實(shí)上，IL13Rα2靶向的G2 4－1BB CAR－T細(xì)胞表面組成性表達(dá)的CD27分子大大減少了CAR－T細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其耗竭和凋亡。

總之，CD27介導(dǎo)的共刺激可以增強(qiáng)不同的CAR－T細(xì)胞特征，如CAR－T細(xì)胞的持久性和細(xì)胞毒性。臨床上，CD27／CD28共刺激組合在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、AML和淋巴瘤患者中產(chǎn)生了令人印象深刻的反應(yīng)。然而，在CAR－T細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，CD27和其他共刺激分子的組合也應(yīng)仔細(xì)考慮，以避免終末分化和耗竭。

CD40的共刺激結(jié)構(gòu)域

CD40在髓源性抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)，如樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。CD40配體（CD40L）主要在活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)。在APC上，CD40與CD40L的結(jié)合激活抗原呈遞和共刺激信號(hào)，從而促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活和擴(kuò)增。

在最初的研究中，無(wú)論是G2型還是帶有CD28結(jié)構(gòu)域的G3型，CD40或4－1BB CAR－T細(xì)胞之間的抗原特異性靶細(xì)胞殺傷均未觀察到差異。然而，與4－1BB共刺激相比，CD40共刺激確實(shí)觸發(fā)了更強(qiáng)的NF－κB激活。

為了增強(qiáng)共刺激信號(hào)，CD40 CAR－T細(xì)胞已與CAR結(jié)構(gòu)中的其他共刺激分子結(jié)合，例如與B細(xì)胞信號(hào)部分的CD79A結(jié)合，這兩種受體都激活下游的NF－κB、NFAT和AP－1信號(hào)。與CD28或4－1BB共刺激的CAR－T細(xì)胞相比，CD79A／CD40CAR－T細(xì)胞在體外與CD19表達(dá)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，NF－κB和p38活性升高，增殖更多。在接種Raji腫瘤細(xì)胞的小鼠中，與CD28或4－1BB共刺激的CAR－T細(xì)胞相比，CD79A／CD40共刺激的CAR－T細(xì)胞也具有更好的抗腫瘤活性和增殖活性。

HEVM和GITR的共刺激結(jié)構(gòu)域

HVEM和GITR最近也被納入到CAR－T細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。HVEM具有免疫刺激和免疫抑制功能，并與配體CD160、BTLA、LIGHT和LTα相互作用。HVEM在各種免疫細(xì)胞上表達(dá)，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。HVEM與LIGHT或LTα的結(jié)合導(dǎo)致T細(xì)胞活化和增殖，而HVEM與T細(xì)胞表達(dá)的BTLA的結(jié)合抑制T細(xì)胞活化。此外，HVEM還調(diào)節(jié)CD8＋T細(xì)胞的效應(yīng)器和記憶形成。

到目前為止，HVEM作為CAR－T細(xì)胞的共刺激結(jié)構(gòu)域僅被報(bào)道過(guò)一次，與對(duì)照CD28或4－1BB G2 CAR－T細(xì)胞相比，HVEM G2 CAR－T細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞毒性和促炎細(xì)胞因子生成，例如IL－2、TNF－α和IFN－γ。此外，HVEMG2 CAR－T細(xì)胞中的CAR－T耗竭降低，并且檢測(cè)到Tcm和Tem細(xì)胞的等效百分比。相比之下，在CD28和4－1BB CAR－T細(xì)胞中，Tem和Tcm亞群分別高度富集。因此，HVEM G2 CAR－T細(xì)胞似乎產(chǎn)生了更平衡的CAR－T細(xì)胞表型。有趣的是，在體外的HVEM CAR－T細(xì)胞中檢測(cè)到糖酵解和線粒體呼吸水平增強(qiáng)。因此，HVEM共刺激似乎增加了能量代謝，這一特征與T細(xì)胞耗竭減少正相關(guān)。

CAR－T共刺激域的另一個(gè)TNFRSF成員是GITR。與4－1BB或OX40不同，GITR在T細(xì)胞上呈組成性表達(dá)，在CD4／CD25／Foxp3陽(yáng)性Treg上的表達(dá)高于幼稚或記憶性T細(xì)胞。此外，在TCR激活后，效應(yīng)T細(xì)胞上GITR的表達(dá)上調(diào)。GITR激動(dòng)劑抑制Treg的抑制活性并提高效應(yīng)T細(xì)胞的存活率。

在EGFR靶向的CAR－T細(xì)胞中，GITR共刺激產(chǎn)生的抗腫瘤活性與各種腫瘤細(xì)胞系中CD28或4－1BB G2 CAR－T細(xì)胞相當(dāng)，甚至更強(qiáng)。靶向CD19的GITR G2 CAR－T細(xì)胞在體內(nèi)也顯著抑制了Raji腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，與共刺激CAR－T結(jié)構(gòu)域DAP－10、CD28、4－1BB、ICOS和OX40相比，GITR共刺激在T細(xì)胞淋巴瘤和黑色素瘤模型體內(nèi)表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。然而，與CD28 CAR－T細(xì)胞相比，GITR共刺激確實(shí)減少了TNF－α、IL－2和Th17相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，并誘導(dǎo)了更分化的效應(yīng)器表型，同時(shí)降低了體內(nèi)持久性。

總結(jié)與展望

在CAR－T細(xì)胞中添加的各種TNFRSF成員的共刺激域中，不同的TNFRSF成員之間具有明顯優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。顯然，通過(guò)選擇和／或組合不同的共刺激域，可以極大地影響和驅(qū)動(dòng)CAR－T細(xì)胞的效果。

在這方面，在最近的比較中，臨床產(chǎn)品中通常使用的CD28和4－1BB共刺激結(jié)構(gòu)域明顯優(yōu)于其它共刺激結(jié)構(gòu)域，包括OX40、ICOS或CD27。因此，進(jìn)一步工程化CAR－T細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可能產(chǎn)生增強(qiáng)的功能。例如，OX40共刺激結(jié)構(gòu)域類似于4－1BB，可用于增強(qiáng)CAR－T細(xì)胞的持久性，但與CD28共刺激結(jié)構(gòu)域相比，其對(duì)效應(yīng)器功能的激活減少。GITR共刺激結(jié)構(gòu)域可用于驅(qū)動(dòng)效應(yīng)器功能，但與CD28一樣，與持久性降低有關(guān)。此外，在激發(fā)持久的抗癌反應(yīng)方面，OX40共刺激被證明優(yōu)于4－1BB共刺激，而CD40 CAR－T細(xì)胞似乎對(duì)內(nèi)源性免疫也有強(qiáng)烈的刺激作用。

特別是，G3或G4 CAR－T細(xì)胞中不同共刺激結(jié)構(gòu)域的組合可能產(chǎn)生額外的臨床益處，因?yàn)椴煌�的CAR－T細(xì)胞功能可以組合以產(chǎn)生協(xié)同活性。例如，通過(guò)結(jié)合CD28和OX40共刺激結(jié)構(gòu)域，早期效應(yīng)器表型與持久性和持久性抗腫瘤反應(yīng)相結(jié)合，優(yōu)于CD28／4－1BB結(jié)合的CAR－T細(xì)胞。在另一種G3 CAR－T細(xì)胞方法中，CD28分別結(jié)合4－1BB和CD40的共刺激，后者顯示出最有效的共刺激效應(yīng)。

此外，除了確定要選擇CAR－T細(xì)胞結(jié)構(gòu)中TNFRSF家族的哪個(gè)成員外，還應(yīng)注意ICD結(jié)構(gòu)域的順序、要選擇哪個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及鉸鏈／間隔區(qū)的設(shè)計(jì)。共刺激域在CAR結(jié)構(gòu)中的定位可以極大地影響CAR－T細(xì)胞的功能，并決定是否可以從共刺激域獲得額外的益處。

最后，還要考慮TME的影響。最近的研究表明，用環(huán)磷酰胺預(yù)處理可有效地修飾免疫抑制性TME，從而在轉(zhuǎn)移性前列腺癌和胰腺癌模型中產(chǎn)生靶向PSCA的4－1BB CAR－T細(xì)胞的持久治療反應(yīng)。此外，調(diào)節(jié)CAR－T也可能有助于修飾TME，OX40 G2 CAR－T細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎分子IL－10水平明顯低于CD28 G2 CAR－T細(xì)胞。與CD28 G2 CAR－T細(xì)胞相比，G3 CAR－T細(xì)胞中的CD28聯(lián)合OX40刺激也降低了IL－10水平，并阻止了CAR－T細(xì)胞的自動(dòng)抑制。因此，CD28和OX40聯(lián)合刺激可能適用于靶向免疫抑制TME的CAR－T細(xì)胞。

不同TNFRSF成員的不同作用仍在探索中，我們對(duì)這一獨(dú)特家族的理解可能還存在差距。盡管如此，這些成員的全部潛力被釋放只是時(shí)間問(wèn)題，無(wú)論是單獨(dú)還是與其他TNFRSF成員聯(lián)合使用。很明顯毫無(wú)疑問(wèn)，在下一代CAR－T細(xì)胞中，TNFRSF成員將繼續(xù)發(fā)揮核心、多樣和重要的作用。

參考文獻(xiàn)：

1． The Implementation of TNFRSF Co－StimulatoryDomains in CAR－T Cells for Optimal Functional Activity． Cancers （Basel）． 2022Jan； 14（2）： 299．

       原文標(biāo)題 : 聊一聊CAR-T細(xì)胞中的共刺激域