角膜提供了眼睛的大部分折射能力,由5層組成(圖1),從外到內(nèi)依次是上皮層,鮑曼層、基質(zhì)、角膜后彈力層(間質(zhì)膜)、內(nèi)皮層。

圖1 角膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

上皮層負責(zé)阻擋異物落入角膜,厚約50μm,由三種細胞構(gòu)成,從外到內(nèi)依次是表層細胞、翼細胞和基底細胞。只有基底細胞可進行有絲分裂和分化,基底細胞的補充是由從角膜邊緣的干細胞完成的。翼細胞由基底細胞分化而來,處于中度分化狀態(tài),形狀像羽翼。表層細胞完全分化,不斷脫落�；�底細胞下方有一層基底膜,由基底細胞分泌而來。

鮑曼層是一層無細胞結(jié)構(gòu)的薄膜,厚8～12μm,主要成分為雜亂交織的膠原蛋白纖維。

基質(zhì)厚約450μm,占角膜厚度的90%,是維持角膜形狀、強度和透明性的主力,由規(guī)則分布的膠原蛋白纖維、基質(zhì)細胞和基質(zhì)外成分構(gòu)成�；�質(zhì)結(jié)構(gòu)中,長度和直徑均一的膠原蛋白平行分布,構(gòu)成片晶結(jié)構(gòu),多個片晶制成起整個基質(zhì)�；�質(zhì)細胞通過合成膠原蛋白和基質(zhì)外成分對基質(zhì)進行保養(yǎng)和再生。基質(zhì)部分通過水合作用對角膜的含水量進行調(diào)控。

角膜后彈力層(間質(zhì)膜)是內(nèi)皮層的基底,由膠原分子和糖蛋白構(gòu)成,厚度隨年齡增大而增長,新生兒厚約3～5μm,老年人厚約10～15μm。

內(nèi)皮層厚5μm,由單層多角細胞構(gòu)成,代謝水平高,負責(zé)抽運水分子,調(diào)控角膜的水合作用。

角膜的生理學(xué)基礎(chǔ)主要介紹營養(yǎng)供給與氧氣供給。角膜獲得營養(yǎng)物質(zhì)是通過眼房水和邊緣的毛細血管獲得,而氧氣是通過淚膜中的擴散獲得。角膜在睜眼時有氧呼吸產(chǎn)生ATP供能,睡眠時無氧呼吸產(chǎn)生ATP供能。當(dāng)角膜發(fā)生病變時會影響角膜的代謝方式。

傳統(tǒng)成像方式有裂隙燈顯微成像,共焦距顯微成像和光學(xué)相干斷層掃描成像(OCT)三種。裂隙燈顯微成像由雙目望遠鏡和長、寬、入射角可調(diào)的光源組成,最早應(yīng)用于角膜成像中,但無法獲得細胞層面的信息。共焦距顯微成像使用小孔濾去焦距外的信號,可獲得細胞解剖學(xué)和密度信息,但無法獲得代謝信息。OCT成像速度快,可獲得角膜層次結(jié)構(gòu)信息,成像深度大,但無法獲得代謝信息。

雙光子顯微成像成像深度大,分辨率在亞細胞水平,可獲得細胞代謝和基質(zhì)結(jié)構(gòu)的信息。細胞代謝信息可通過對細胞內(nèi)源性分子(如NAD(P)H和FAD)熒光成像獲得(圖2,其中紅色為NAD(P)H,綠色為FAD),基質(zhì)結(jié)構(gòu)信息可通過膠原蛋白纖維的二次諧波產(chǎn)生獲得。

圖2 雙光子熒光對角膜細胞結(jié)構(gòu)成像 [1]

內(nèi)源分子的種類可通過熒光的光譜、強度、熒光壽命進行分辨,雙光子成像有雙光子熒光強度成像、雙光子熒光壽命成像和二次諧波產(chǎn)生成像三種。在強度成像中,同種分子不同的氧化還原狀態(tài)信號不同,反應(yīng)了新陳代謝信息。在熒光壽命成像中,同種分子處在不同微環(huán)境時所發(fā)熒光的持續(xù)時間不同,據(jù)此可判斷其是否與蛋白質(zhì)結(jié)合,從而判斷代謝狀態(tài)。二次諧波成像中,近紅外激光可激發(fā)膠原蛋白產(chǎn)生二次諧波,獲得基質(zhì)層結(jié)構(gòu)信息。

雙光子顯微成像系統(tǒng)由鈦寶石近紅外光源、3維掃描組塊,光展寬器、衰減器、顯微物鏡和光電倍增管構(gòu)成,有5D激光掃描顯微鏡(圖3)和多光子斷層掃描儀MPTflex兩種裝置。

圖3 雙光子顯微成像設(shè)備示意圖 (a) 5D激光掃描顯微鏡 (c)MPTflex [1]

圖4使用多光子斷層掃描儀MPTflex 獲得,展示了線粒體較少的上皮層表層細胞(圖4(a),圖4(b)),線粒體中等的翼細胞(圖4(c)),線粒體較多且集中在細胞核附近的基底細胞(圖4(d)),鮑曼層存在基底細胞(圖4(e),圖4(f)的紅色)和膠原蛋白(綠色),基質(zhì)層存在豐富的膠原蛋白(圖4(g),圖4(h)的綠色)和少量基質(zhì)細胞(箭頭),角膜后彈力層內(nèi)源熒光信號強(圖4(i)),但膠原蛋白的無規(guī)則分布阻礙了二次諧波產(chǎn)生,內(nèi)皮層線粒體密集(圖4(j))。

圖4 多光子斷層掃描儀MPTflex對細胞不同層次形態(tài)成像 [1]

而使用二次諧波成像可獲得基質(zhì)層膠原蛋白結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 二次諧波對基質(zhì)部分膠原纖維的成像 [1]

雙光子成像可對角膜上皮層進行形態(tài)學(xué)和新陳代謝分析(圖6),來進行角膜移植前的評估。其中主要評估的是角膜內(nèi)皮層的細胞密度狀態(tài),除此之外還可以通過代謝狀態(tài)分析內(nèi)皮層病理學(xué)狀態(tài)。雙光子成像還可以分辨角膜疾病,圖7為角膜上皮層成像,其中(a)為正常角膜,(b)為圓錐形角膜,(c)為棘阿米巴角膜炎,細胞形態(tài)有明顯變化。圖8為無病理及患有圓錐角膜及棘阿米巴角膜炎角膜基質(zhì)的二次諧波成像,(a)為正常角膜,(b)為圓錐形角膜,(c)為棘阿米巴角膜炎,病理組織的二倍頻信號異于正常組織。

圖6 多光子顯微鏡對角膜進行角膜移植前評估 [1]

圖7 無病理組織(a),圓錐角膜癥組織(b)及棘阿米巴角膜炎組織(c)的雙光子形態(tài)學(xué)成像 [1]

圖8 無病理組織(a),圓錐角膜癥組織(b)及棘阿米巴角膜炎組織(c)的二倍頻成像 [1]

眼角膜病變是致盲的重要原因,傳統(tǒng)成像方法(如裂隙燈顯微成像、共焦距顯微成像、光學(xué)相干斷層掃描成像)無法對活體角膜細胞成像,獲得有關(guān)細胞的代謝水平和角膜基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)的信息。雙光子成像通過激發(fā)內(nèi)源特異性熒光和二次諧波,獲得角膜細胞形態(tài)、新陳代謝狀況和基質(zhì)結(jié)構(gòu)的信息,從而可以在角膜移植和病理診斷中發(fā)揮重要作用。

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多光子顯微鏡成像技術(shù)之六:多光子顯微鏡用于體內(nèi)神經(jīng)元成像的多種技術(shù)

參考文獻:

[1] K?nig, Karsten． Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging [M]．