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引言

上世紀(jì)80年代，首批重組蛋白藥物獲批上市，標(biāo)志著生物醫(yī)藥進(jìn)入全新紀(jì)元。如今，全球70%的重磅生物藥依賴(lài)重組蛋白技術(shù)，覆蓋癌癥、自身免疫病、傳染病等重大疾病治療。這場(chǎng)革命的基石，正是不斷迭代的蛋白表達(dá)系統(tǒng)——它不僅是實(shí)驗(yàn)室工具，更是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“分子藥廠”。

從胰島素到單克隆抗體，治療性蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)依賴(lài)于表達(dá)系統(tǒng)的持續(xù)革新。隨著基因工程技術(shù)的突破，表達(dá)系統(tǒng)已從單一的原核體系發(fā)展為覆蓋原核、真核乃至無(wú)細(xì)胞的多維技術(shù)網(wǎng)絡(luò)。

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一、原核表達(dá)系統(tǒng)

在過(guò)去的四十年里，大腸桿菌一直是蛋白質(zhì)表達(dá)的主要宿主。細(xì)菌系統(tǒng)的廣泛使用主要來(lái)自實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中實(shí)施的低成本、最低的技術(shù)要求和細(xì)菌培養(yǎng)的極短倍增時(shí)間。同時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)物可以很容易地?cái)U(kuò)大規(guī)模，以實(shí)現(xiàn)高通量處理所需的自動(dòng)化。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)成功適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)項(xiàng)目的例子有很多，包括篩選數(shù)百個(gè)表達(dá)克隆和大規(guī)模生產(chǎn)選定的蛋白質(zhì)。

盡管細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)一直是蛋白質(zhì)表達(dá)研究的“主力”，但在真核蛋白質(zhì)的表達(dá)方面，該系統(tǒng)存在許多局限性。大腸桿菌是一種原核生物，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)與真核生物非常不同，其更簡(jiǎn)單的機(jī)制無(wú)法正確折疊外源蛋白，也無(wú)法進(jìn)行天然表達(dá)的真核蛋白中常見(jiàn)的翻譯后修飾（PTM）。因?yàn)榇竽c桿菌表達(dá)的真核蛋白質(zhì)具有非常小的PTM，這些蛋白質(zhì)通常沒(méi)有正確折疊，因此有時(shí)是不溶的。在某些情況下，這些限制可以通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因細(xì)菌表達(dá)菌株、改變蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽或進(jìn)行額外的蛋白質(zhì)復(fù)性步驟來(lái)規(guī)避。

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二、酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母細(xì)胞是真核生物，因此，它們具有多細(xì)胞生物的復(fù)雜生物學(xué)特性，能夠產(chǎn)生進(jìn)行蛋白水解加工和脂質(zhì)化等PTM的蛋白質(zhì)。與細(xì)菌相似，酵母在基因上易于操縱，生長(zhǎng)速度快，在培養(yǎng)中可以實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度。酵母蛋白表達(dá)常用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)-DNA相互作用。然而，由于酵母中存在的內(nèi)蛋白酶和外蛋白酶對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)的快速降解，從酵母培養(yǎng)物中回收大量所需的蛋白質(zhì)可能很困難。此外，由于低聚糖結(jié)構(gòu)與人類(lèi)糖蛋白和糖基化模式（高甘露糖化）的差異，許多酵母生產(chǎn)的重組蛋白不適合制藥應(yīng)用。

廣泛用于生產(chǎn)功能性蛋白質(zhì)的酵母有巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和多形漢薩酵母。例如，酵母表達(dá)系統(tǒng)通常用于生產(chǎn)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），這是一個(gè)跨膜受體的大蛋白家族，可以感知細(xì)胞外的分子并激活細(xì)胞反應(yīng)。蛋白酶缺陷型巴斯德畢赤酵母正在成為最受歡迎的酵母表達(dá)系統(tǒng)之一，并已成功用于生產(chǎn)高達(dá)0.35mg/L培養(yǎng)物的膜蛋白。

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三、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)通常是制造生物制藥的首選平臺(tái)。近年來(lái)，觀察到這些表達(dá)系統(tǒng)的使用穩(wěn)步增加。這是因?yàn)槿藗儗?duì)生產(chǎn)需要特定翻譯后修飾（最明顯的是糖基化）的大型復(fù)雜分子的需求越來(lái)越多，這些修飾僅發(fā)生在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中。此外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和一般動(dòng)物細(xì)胞系的情況下，大多數(shù)重組蛋白可以分泌，不需要像原核表達(dá)系統(tǒng)那樣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解來(lái)提取，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊。然而，由于可能受到動(dòng)物病毒的污染，細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)引發(fā)了潛在的安全問(wèn)題。細(xì)胞系中蛋白質(zhì)生產(chǎn)的其他缺點(diǎn)包括復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)需求、緩慢的生長(zhǎng)和脆弱性，以及相對(duì)較高的生產(chǎn)時(shí)間和成本。目前可用的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系（如NS0、BHK和Sp2/0）和人類(lèi)細(xì)胞系（例如HEK293、PER.C6、HT-1080和CAP）。在現(xiàn)有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系是重組蛋白生產(chǎn)的主要選擇，2016年最暢銷(xiāo)的10種生物制藥中有7種是在這些細(xì)胞中生產(chǎn)的。

-05-四、

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

雖然目前生物制藥最常用的是哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，但其蛋白質(zhì)產(chǎn)量相對(duì)較低，并且需要費(fèi)力的放大過(guò)程。因此，相對(duì)來(lái)說(shuō)，它可能是最不經(jīng)濟(jì)的表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)解決了人類(lèi)衍生蛋白質(zhì)之間糖基化和三維折疊的需求，需要這些特征來(lái)進(jìn)行生物活性，同時(shí)避免哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)可能對(duì)人類(lèi)健康造成問(wèn)題的病毒污染的敏感性。蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，如鱗翅目昆蟲(chóng)，該昆蟲(chóng)屬包括蝴蝶和飛蛾。其他常用的昆蟲(chóng)細(xì)胞類(lèi)型包括草地貪夜蛾（秋軍蟲(chóng)）、家蠶、卷葉蛾（卷心菜彎蟲(chóng)）和二葉蛾（森林帳篷毛蟲(chóng)）。屬于這一組的所有昆蟲(chóng)都容易感染桿狀病毒，這種昆蟲(chóng)病毒的遺傳物質(zhì)是將外源蛋白插入昆蟲(chóng)細(xì)胞的載體。大多數(shù)桿狀病毒表達(dá)載體都是基于Autographa californica多核多角體病毒（AcMNPV）。AcMNPV桿狀病毒顆粒攜帶120-150 kb的雙鏈基因組DNA，可以容納另外100 kb的外源遺傳物質(zhì)，這為插入單個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)構(gòu)建體提供了幾乎無(wú)限的能力。最常用的桿狀病毒啟動(dòng)子之一是polyhedron啟動(dòng)子，它在桿狀病毒生命周期的后期調(diào)節(jié)桿狀病毒polyhedron蛋白的表達(dá)。昆蟲(chóng)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)允許蛋白質(zhì)PTM（信號(hào)肽切割、磷酸化、脂質(zhì)修飾和糖基化）以及折疊（二硫鍵形成、寡聚化），類(lèi)似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)物（SF9、SF21等）易于擴(kuò)大規(guī)模，可以在27°C下作為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞維持，這對(duì)溫度敏感突變體的表達(dá)至關(guān)重要。作為另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，polyhedron啟動(dòng)子在桿狀病毒復(fù)制周期的后期是活躍的，并且允許有毒基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的有害影響最小。桿狀病毒只感染昆蟲(chóng)，對(duì)人類(lèi)沒(méi)有致病性。因此，基于桿狀病毒的蛋白質(zhì)表達(dá)只需要生物安全1級(jí)。由于以上這些優(yōu)點(diǎn)，在過(guò)去的10年里，桿狀病毒蛋白表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛用于酶制造、結(jié)構(gòu)研究的大規(guī)模樣品制備以及疫苗開(kāi)發(fā)。

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五、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

植物源生物制藥的生產(chǎn)引起了人們的極大興趣。轉(zhuǎn)基因植物有可能成為大規(guī)模生產(chǎn)人類(lèi)治療性蛋白質(zhì)的成本效益高的系統(tǒng)。植物的使用消除了治療藥物與動(dòng)物病原體的潛在污染，因?yàn)橹参锛?xì)胞培養(yǎng)物不易受哺乳動(dòng)物病毒病原體的影響，此外，植物病毒不會(huì)感染人類(lèi)細(xì)胞。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在可食用植物中表達(dá)的口服免疫原性重組蛋白可以在不進(jìn)行加工的情況下口服給藥，去除了昂貴的純化步驟。此外，植物表達(dá)系統(tǒng)能夠產(chǎn)生具有復(fù)雜糖基化模式的蛋白質(zhì)；然而，所產(chǎn)生的聚糖結(jié)構(gòu)與人類(lèi)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)明顯不同。用于重組蛋白生產(chǎn)的植物表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)與生產(chǎn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)，這使得該技術(shù)不適合快速生產(chǎn)對(duì)抗新出現(xiàn)疾病的藥物。另一個(gè)問(wèn)題是，目前植物生物技術(shù)中的方法無(wú)法以一致的方式精確控制植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。作為使用整株植物作為生物反應(yīng)器的替代方案，在使用植物細(xì)胞培養(yǎng)物方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，如胡蘿卜懸浮培養(yǎng)物和煙草BY-2細(xì)胞。到目前為止，成功生產(chǎn)并在植物中正確折疊的生物制藥蛋白質(zhì)的主要類(lèi)別是亞單位疫苗和病毒樣顆粒（VLP）、抗體和治療酶，其中包括幾種已經(jīng)完成II期試驗(yàn)并接近商業(yè)化的產(chǎn)品。2012年，重組人葡萄糖腦苷脂酶（Elelyso）成為FDA批準(zhǔn)用于人體給藥的第一種植物生產(chǎn)的生物藥。

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六、無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)

蛋白質(zhì)表達(dá)也可以在體外使用純化的RNA聚合酶、核糖體、轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）和核糖核苷酸進(jìn)行。這些試劑可以通過(guò)從細(xì)胞或基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中提取來(lái)生產(chǎn)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)合成發(fā)生在細(xì)胞裂解物中，而不是在培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，這種方法也被稱(chēng)為無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的使用正成為基于細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)的一種有吸引力的替代方案，因?yàn)樗�提供了一種簡(jiǎn)單、開(kāi)放和靈活的方法來(lái)快速合成折疊的蛋白質(zhì)。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的開(kāi)放性使其易于修改，從而允許添加外部分子，為蛋白質(zhì)折疊和活性創(chuàng)造有利條件。例如，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)可用于摻入非天然或化學(xué)修飾的氨基酸，以協(xié)助標(biāo)記蛋白質(zhì)用于下游應(yīng)用。在真核裂解物中可以實(shí)現(xiàn)許多PTM：糖基化、肽切割、乙酰化、磷酸化、精氨酸甲基化等。將非天然或化學(xué)修飾的氨基酸摻入正在生產(chǎn)的蛋白質(zhì)中的能力已被應(yīng)用于基于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)創(chuàng)建幾種蛋白質(zhì)技術(shù)：蛋白質(zhì)原位陣列（PISA）、核酸可編程蛋白質(zhì)陣列（NAPPA）、DNA到蛋白質(zhì)陣列（DAPA）等。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)仍然被認(rèn)為是一個(gè)相對(duì)較新的平臺(tái)。由于蛋白質(zhì)表達(dá)水平低和成本高，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)不如基于細(xì)胞的系統(tǒng)廣泛采用。這些系統(tǒng)需要進(jìn)一步優(yōu)化，特別是提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。-08-結(jié)語(yǔ)蛋白表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)化史，本質(zhì)是精度、成本與效率的三角平衡。原核系統(tǒng)仍是基礎(chǔ)研究的利器，哺乳動(dòng)物細(xì)胞保持著治療性蛋白的主力，而植物與無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)正開(kāi)辟全新賽道。隨著合成生物學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)療的融合，未來(lái)或?qū)��?shí)現(xiàn)“按需定制表達(dá)”——根據(jù)蛋白特性自動(dòng)匹配最優(yōu)系統(tǒng)。

       原文標(biāo)題 : 蛋白表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)化史