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文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

微生物來源的耐熱脂肪酶常常在大腸桿菌中大量過表達(dá)，但是，這些酶通常以低酶活性存在，并且主要以包涵體的形式存在。一些研究指出，將其N末端與信號(hào)肽融合、使重組蛋白進(jìn)行分泌表達(dá)，可有效解決這個(gè)問題。一般來說，這種方法的可行性在很大程度上取決于信號(hào)肽的分泌途徑和要分泌的目標(biāo)蛋白的類型。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院Weiqing Zhang等人在2018年在《Microbial Cell FactoriesMicrobial Cell Factories》（IF＝4．402，工程技術(shù)二區(qū)）上發(fā)表了題為“Development an effective system to expression recombinant protein in E． coli via comparison and optimization of signal peptides： Expression of Pseudomonas fluorescens BJ－10 thermostable lipase as case study”的文章。該研究對(duì)熒光假單胞菌BJ－10高效分泌耐熱脂肪酶lipBJ10的信號(hào)肽進(jìn)行了比較和優(yōu)化。同時(shí)，將該方法與細(xì)胞質(zhì)分泌法在分泌可溶性和活性脂肪酶方面進(jìn)行了比較研究。本文報(bào)道的結(jié)果可為其他脂肪酶的高水平表達(dá)提供參考。

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所用到的主要方法

METHODS

1．雙星膽堿酸法蛋白定量（BCA）

2．實(shí)時(shí)定量分析

3．形態(tài)計(jì)量分析

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

脂肪酶（三酰甘油酯水解酶，E．C．3．1．1．3）可以催化長(zhǎng)鏈三酰甘油的水解，在水介質(zhì)中釋放長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油。因絕大多數(shù)脂肪酶熱穩(wěn)定性差，野生型菌株產(chǎn)生的脂肪酶產(chǎn)量低，故而嗜熱和耐熱微生物脂肪酶目前需求量很大。本文依據(jù)前期獲得的脂肪酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但該脂肪酶的可溶性較差，所以構(gòu)建了6株攜帶不同融合表達(dá)質(zhì)粒的菌株，通過比較這6株菌株的性能，確定了最佳的信號(hào)序列，篩選出了最優(yōu)的蛋白信號(hào)肽（DsbA）以增強(qiáng)其可溶性蛋白表達(dá)。

研究表明使用6個(gè)信號(hào)肽，即PelB和5個(gè)天然大腸桿菌信號(hào)肽作為融合伴侶進(jìn)行融合表達(dá)，可以比非融合表達(dá)產(chǎn)生更多的可溶性和功能性重組lipBJ10。重組lipBJ10與這六種不同的信號(hào)肽融合后，可在大腸桿菌中分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。所有融合表達(dá)的總脂肪酶活性均高于非融合表達(dá)。當(dāng)lipBJ10與DsbA融合時(shí)，相對(duì)活性達(dá)到峰值，產(chǎn)生的蛋白活性是非融合蛋白的73．3倍。當(dāng)使用DsbA作為融合伙伴時(shí)，活性最高（265．41 U／ml），包涵體的形成最少；其它4個(gè)大腸桿菌信號(hào)肽在一定程度上會(huì)導(dǎo)致活性低且不溶于包涵體。因此，DsbA是與lipBJ10融合的最佳信號(hào)肽伴侶，可以有效地生產(chǎn)可溶性和功能性蛋白。與未進(jìn)行融合的蛋白lipBJ10相比，融合有這些信號(hào)肽，特別是DsbA的信號(hào)肽，可以顯著減少包涵體的形成，增強(qiáng)lipBJ10的功能和溶解性。

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