附圖1D：在患者標本中對于所有細胞的聚類結果

對于無法通過自舉分析分離的的生物學相關亞型（例如，來自腫瘤和腫瘤周圍組織的淋巴EC），作者根據(jù)先前的研究，確定它們在統(tǒng)計學上是可以使用成對差異分析來分離的。13個表型中的每一個都按圖1C所示編號（H1，H2等）。

作者根據(jù)hPNEC和hTEC中排名最高的標記基因的相對豐度對亞型進行生物學注釋，并對顯著的標記基因表達水平差異進行統(tǒng)計量化以支持定性生物學注釋（圖1D–1G和S1E）。

圖1D：t－SNE聚類后的亞群標記基因的表達分布情況 

E：標記基因在不同亞組中的表達熱圖 

F：在hTECs和hpNECs不同EC亞型的占比 

G：每種亞型在hTEC和hpNEC中的占比情況

為了獲得更可靠的解釋，作者關注不同亞型的特異基因集并基于規(guī)范的基因集（表S5）對亞型進行分析。為了提高分析的通用性，所有聚類的分類都被分析了至少一次。

作者對先前記錄亞組中排名最高的標記基因作用的詳細描述，用于推斷每個亞型的假定生物學作用。

表S5（部分）：用于定義聚類的基因集

作者對于每一個聚類的通過其高表達基因集進行了生物學功能的分析：

動脈EC（簇H1）表達的基因涉及血管完整性，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和血管收縮（圖2A），而毛細血管后靜脈EC（H2）表達的基因與白細胞募集，組織灌注和肺動脈血壓有關（圖2B）。

作者確定了I型（H3）和II型（H4）肺泡毛細血管EC表型，其特征在于血管性血友病因子（vWF，II型相比I型上調(diào)；倍數(shù)＝ 3．63，adj．p＜0．001）和黏蛋白（EMCN，I型與II型相比上調(diào)；倍數(shù)＝ 2．89，adj．p＜0．001），它們可能分別參與血管調(diào)節(jié)和抗微生物防御（圖2C–  2E）。

與所有其他簇相比，毛細血管內(nèi)皮細胞表達了參與MHC－II介導的抗原呈遞和加工的基因，其表達水平高于其他表型（圖2F），但共刺激分子CD80和CD86卻未檢測到，提示其具有專職抗原呈遞細胞（APC）的功能。

確定了2種可能由腫瘤源性細胞因子誘導的新型毛細血管表型：清除毛細血管（scavenging capillaries ）（H5）在自舉分析結果中顯示出類似于II型毛細血管內(nèi)皮細胞的特征，而其清除受體和與巨噬細胞及抗原加工相關的基因上調(diào)表達（圖2G，2H 和S1D），激活毛細血管（H6）則表達EC激活標記（圖2I）。

中間毛細血管EC表型（H7）類似于活化的毛細血管，但其主要由單個患者衍生的細胞組成。

圖2：肺正常組織EC各亞型的基因表達差異情況

作者隨后探究了在腫瘤組織中特異性的EC，結果顯示：

傳統(tǒng)的血管生成表型，例如tip和增生的EC（假定為抗血管生成治療［AAT］的靶標），僅在hTEC中可檢測到（圖3A，S1E和S2A）。tip EC（H8）與EC遷移，基質重塑和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號傳導相關的基因特征相關（圖3B），但其僅在少數(shù)（＜10％）hTEC中被檢測到（圖S1E）。

值得注意的是，tip hTECs顯示出疾病特異性分子PGF（胎盤生長因子；PlGF ）的高度限制表達。

發(fā)現(xiàn)了一個不成熟的hTEC表型（H9）與tip  EC相似，但是其上調(diào)的基因參與了新生血管的成熟，血管屏障完整性和Notch信號轉導，作者推測其可能類似于莖狀EC（圖3C和S1D） 。

僅在一部分患者中檢測到增殖的hTECs，占hTECs的＜1％，并且在批量校正后不再作為單獨的簇被檢測到（圖S2A）。

在hTECs中，激活的毛細血管后靜脈表型（H10）上調(diào)表達了免疫調(diào)節(jié)因子和核糖體蛋白（圖3D），這是發(fā)炎組織中高內(nèi)皮小靜脈（HEVs）的特征。

與血管內(nèi)皮細胞廣泛的表型異質性相反，腫瘤和腫瘤周圍淋巴內(nèi)皮細胞（LEC；H11，H12）的基因表達特征高度相似，并且未檢測到LEC亞群（圖3E和S1）。

圖3：A：hnNEC與hTEC之間的EC表型差異 

D－C：不同EC之間的基因表達差異

附圖2A：各樣品中增殖EC的存在情況

為了探索本研究中采用的NSCLC EC分類標準的通用性，作者使用了排名最高的標記基因來訓練機器學習算法，以自動注釋方式從來自5位未接受過治療的NSCLC患者（公開數(shù)據(jù)集）的腫瘤的52，698個細胞目錄中以計算機方式注釋574個hPNEC和638個hTEC。大多數(shù)EC分類具有高置信度注釋（相似性閾值＞ 0．5）（圖3F），這表明分類法是外部有效的。

圖3F：將hTEC和hPNEC表型與組織分類相關聯(lián)的�；鶊D

作者使用正交技術以驗證分類法的可靠性，通過免疫染色結合定量RNA雜交計數(shù)轉錄本數(shù)期望證實CD31 ＋ ／ CXCR4高tip hTECs中的PGF水平被上調(diào)

免疫染色：

三重免疫染色顯示CXCR4和PlGF在TEC中共定位（圖3G和3H； S2B）。

SELP的免疫染色證實了激活的毛細血管后靜脈EC的特征（圖S2C和S2D）

vWF和EFNB2分別為靜脈和動脈表型（圖S2E–S2H）

HEV特異性MECA－79抗原是HEV表型的特征（圖S2I）

圖3G：細胞中轉錄本PGF和CXCR4的表達情況及計數(shù)

圖3H：NSCLC腫瘤血管的RNAscope圖像（CXCR4（白色）PGF（綠色）CD31（紅色）細胞核（Hoechst））

附圖2B：對CD31，PLGF和CXCR4免疫染色的人NSCLC腫瘤切片的代表性顯微照片

附圖2C－H：NSCLC腫瘤切片（左）正常肺（右側）的免疫熒光照片 

I：對CD31和MECA79免疫染色的人NSCLC腫瘤切片照片

RNAscope：

RNAscope結合EC標記CD31的染色顯示，動脈（EFNB2）和靜脈（ACKR1）標記轉錄本不在同一hTEC中共定位（圖S3A和S3B）

活化毛細血管hTECs表達了標記CCL14（圖S3C）。

清除毛細血管標記CD52和CD68以及I型毛細管標記EDNRB和IL1RL1的轉錄本共定位在同一hTEC中（圖S3D和S3E）。