TCR－T細(xì)胞療法的工作流程

為了分離治療性TCR，必須首先從患者或健康獻(xiàn)血者的血液中分離抗原特異性T細(xì)胞，并在體外用特異性肽抗原以及細(xì)胞因子（如IL－2和IL－15）進(jìn)行擴(kuò)增。這一過程需要事先確定可安全靶向于患者的特定腫瘤相關(guān)肽靶點(diǎn)。在選擇了靶抗原后，可以使用不同的方法來篩選具有所需的高親和力和腫瘤特異性的TCR。臨床前安全性測(cè)試對(duì)于確保分離的高親和力TCR的最小靶外效應(yīng)和交叉反應(yīng)性也是必要的。病毒載體通常用于對(duì)自體患者T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，以表達(dá)經(jīng)驗(yàn)證的治療性TCR，然后再輸回患者體內(nèi)。

確定靶抗原

T細(xì)胞識(shí)別的黑色素瘤抗原1（MART－1）是TCR－T臨床試驗(yàn)中第一個(gè)靶向的腫瘤相關(guān)抗原。在這一突破之后，針對(duì)多種腫瘤抗原的TCR－T療法已經(jīng)開發(fā)出來，包括針對(duì)MAGE－A3、MAGE－A4、GD2、間皮素、gp100、MART1、AFP、CEA、NY－ESO－1以及源自HPV和EBV的病毒肽的TCR－T療法。其中，NY－ESO－1已被證明是TCR－T細(xì)胞最有希望的靶點(diǎn)之一，在治療滑膜肉瘤方面取得了成功，客觀有效率為67％。

理想的TCR－T靶抗原顯示以下特征：（1）誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力；（2）與驅(qū)動(dòng)腫瘤表型（如癌基因）相關(guān)，以降低抗原丟失和腫瘤免疫逃避的風(fēng)險(xiǎn)；以及（3）在腫瘤干細(xì)胞上的表達(dá)以促進(jìn)永久性腫瘤根除。

腫瘤相關(guān)抗原的鑒定方法

高分辨率質(zhì)譜（MS）已被證明是促進(jìn)從腫瘤細(xì)胞直接識(shí)別HLA－I結(jié)合肽的最強(qiáng)大的高通量方法。在這種方法中，通過免疫沉淀（IP）從腫瘤組織或細(xì)胞系中分離HLA－I／肽復(fù)合物，然后充分洗滌并應(yīng)用酸性洗脫緩沖液，從HLA－I分子和用于IP的抗體中分離結(jié)合肽抗原。該策略允許每個(gè)腫瘤樣本識(shí)別數(shù)千個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的肽靶點(diǎn)，并已用于識(shí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GB）、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌（RCC）和結(jié)直腸癌（CRC）等的HLA－I配體。

腫瘤新抗原的鑒定方法

盡管基于MS的技術(shù)可用于識(shí)別新抗原，但由于其相對(duì)較低的豐度以及MS的有限靈敏度，尤其是對(duì)于大小有限的腫瘤樣本，它們更難識(shí)別。然而，新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展有助于識(shí)別和定位這類腫瘤靶點(diǎn)。全外顯子組DNA測(cè)序，結(jié)合計(jì)算預(yù)測(cè)算法，允許識(shí)別癌細(xì)胞中的特定遺傳改變，這些改變可以產(chǎn)生突變肽，并能夠呈現(xiàn)在腫瘤HLA－I分子上。

所有體細(xì)胞突變基因都可以進(jìn)行電腦分析，以預(yù)測(cè)可能與患者個(gè)體HLA－I分子結(jié)合的潛在高親和力表位，從而被T細(xì)胞識(shí)別。隨著大型MS洗脫肽數(shù)據(jù)庫的使用，HLA－I肽結(jié)合預(yù)測(cè)算法不斷更新和改進(jìn)，其他預(yù)測(cè)算法試圖考慮與細(xì)胞內(nèi)過程復(fù)雜性相關(guān)的生物變量。

另一個(gè)經(jīng)常使用的方法是腫瘤RNA測(cè)序，它允許選擇具有最高轉(zhuǎn)錄表達(dá)的新抗原。值得注意的是，盡管這些預(yù)測(cè)方法在識(shí)別呈遞的和高免疫原性新抗原時(shí)通常表現(xiàn)出非常好的準(zhǔn)確性，但它們通常預(yù)測(cè)的新抗原靶點(diǎn)的數(shù)量比真實(shí)靶點(diǎn)的實(shí)際數(shù)量高1到2個(gè)數(shù)量級(jí)。

通過trogocytosis發(fā)現(xiàn)新抗原是近年來出現(xiàn)的一種新方法。Trogocytosis是細(xì)胞結(jié)合過程中發(fā)生的一種生物學(xué)現(xiàn)象，在此過程中，細(xì)胞共享并轉(zhuǎn)移膜和膜相關(guān)蛋白。Li等人發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞膜蛋白特異性轉(zhuǎn)移到腫瘤靶細(xì)胞，這些靶細(xì)胞呈遞同源HLA－I／肽復(fù)合物。利用這些T細(xì)胞－靶細(xì)胞相互作用，他們通過將表達(dá)標(biāo)記孤兒TCR的T細(xì)胞與同源靶細(xì)胞共同孵育，創(chuàng)建了新抗原發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)。通過將熒光標(biāo)記從T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，該方法能夠分離這些靶細(xì)胞并對(duì)同源TCR配體進(jìn)行測(cè)序，從而建立新抗原文庫。

分離腫瘤特異性T細(xì)胞和TCR

使用HLA－I多聚體、單細(xì)胞TCR測(cè)序或抗原陰性的人源化小鼠，腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞和TCR可從自體、異體或異種細(xì)胞庫中識(shí)別鑒定。

利用HLA－I多聚體法，可通過多聚體染色和流式細(xì)胞術(shù)分選直接分離抗原特異性CD8＋T細(xì)胞。在分離成對(duì)的全長(zhǎng)TCR序列之前，對(duì)這些多克隆T細(xì)胞進(jìn)行同源肽識(shí)別和抗腫瘤功能測(cè)試。采用高靈敏度的基于PCR的單細(xì)胞TCR分析方法（TCR－SCAN），可以得到具有高親和力和特異性的TCR。

另外一種方法利用了人源化小鼠TCR基因庫，該基因庫不會(huì)發(fā)生在人類中產(chǎn)生的T細(xì)胞克隆缺失或耐受。為此，Li等人利用整個(gè)人類TCRα／β基因位點(diǎn)和嵌合HLA－A2轉(zhuǎn)基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠，以實(shí)現(xiàn)針對(duì)人類TAA的人類TCR的分離。

單細(xì)胞測(cè)序方法代表了高通量分離腫瘤特異性TCR編碼基因的更有前景的方法。使用靶向TCRα和TCRβ基因座內(nèi)每個(gè)單獨(dú)V和J元件的RNA誘餌文庫，可以從剪切的基因組DNA（gDNA）片段中選擇性分離TCR編碼基因組元件，用于隨后的配對(duì)末端深度測(cè)序。這使得從人類材料或TCR人源化小鼠的寡克隆T細(xì)胞群中鑒定抗原特異性TCR成為可能。

幼稚T細(xì)胞也可以作為TCR－T治療的TCR來源。TAA和新抗原特異性T細(xì)胞可從癌癥患者外周血中的低頻前體中衍生和擴(kuò)增，并可重新輸注或用作抗原特異性TCR的來源。由于癌癥患者通常表現(xiàn)出免疫抑制或顯性T細(xì)胞耐受，HLA－I匹配的健康供體的原始序列也代表了一個(gè)可靠的來源，因?yàn)樗�具有巨大的多樣性TCR序列，理論上T細(xì)胞具有任何抗原特異性，包括腫瘤新抗原。已經(jīng)開發(fā)了高通量技術(shù)平臺(tái)，用于尋找原始的序列，以便快速有效地識(shí)別用于個(gè)性化過繼性T細(xì)胞治療的罕見但有治療價(jià)值的TCR。

TCR的克隆

大多數(shù)基于TCR的基因治療方法依賴于用病毒載體對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，最早用于基因治療的載體是腺病毒。然而，由于它們不能將轉(zhuǎn)基因整合到宿主基因組中，TCR表達(dá)在T細(xì)胞增殖過程中會(huì)丟失。此外，腺病毒的免疫遺傳特性也限制了其作為基因治療載體的應(yīng)用。相比之下，逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體表現(xiàn)出更大的前景，因?yàn)樗鼈兛梢愿腥径喾N細(xì)胞，并有能力將轉(zhuǎn)基因插入宿主基因組，從而使異位TCRα／β鏈穩(wěn)定表達(dá)。

由γ－逆轉(zhuǎn)錄病毒如小鼠白血病病毒（MLV）衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被廣泛用于基因轉(zhuǎn)移到人類T細(xì)胞中。這種方法已被用于傳遞各種基因，包括自殺基因、TCR和CARs。主要缺點(diǎn)是它們不能轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖性靶細(xì)胞，這就排除了靜止的T細(xì)胞在TCR－T治療中的應(yīng)用。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變可能引起潛在的副作用。

最近，慢病毒載體（LV）作為基因轉(zhuǎn)移載體獲得了更多的關(guān)注，因?yàn)樗鼈兛梢詫⒒�因傳遞到分裂和非分裂細(xì)胞中。各種技術(shù)，如Golden Gate克隆和LR克隆，通常用于構(gòu)建插入TCRα／β基因的載體。

腺相關(guān)病毒（AAV）是另一種廣泛使用的病毒載體。與腺病毒載體相比，AAV具有較低的免疫原性和更廣泛的細(xì)胞向性，因此在腫瘤基因治療中得到了廣泛的應(yīng)用。為了促進(jìn)轉(zhuǎn)基因整合，人們開發(fā)了自互補(bǔ)AAV載體（scAAV），使AAV獨(dú)立于宿主細(xì)胞的互補(bǔ)鏈合成，scAAV在臨床前模型中的療效優(yōu)于傳統(tǒng)AAV。

同時(shí)，一些非病毒基因編輯方法也被開發(fā)出來。mRNA電穿孔已被證明可實(shí)現(xiàn)短暫的TCR和CAR表達(dá)，從而將病毒成分持續(xù)存在的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。臨床數(shù)據(jù)表明，mRNA修飾的TCR－T和CAR T細(xì)胞都是可行和安全的，沒有明顯的證據(jù)表明對(duì)正常組織有非靶向毒性。然而，缺乏持續(xù)的TCR表達(dá)可能會(huì)限制療效，需要反復(fù)輸注。此外，非病毒性睡美人反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也被用于TCR和CARs的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

基因編輯通過同源定向修復(fù)（HDR）可以將大基因片段特異、高效地插入靶細(xì)胞。使用CRISPR／CAS9開發(fā)的TCR－T細(xì)胞已被證明在體外特異性識(shí)別腫瘤抗原，并在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生性抗腫瘤反應(yīng)。

TCR的驗(yàn)證方法

在TCR克隆后，需要進(jìn)行廣泛的臨床前驗(yàn)證，以證明工程化TCR－T細(xì)胞的特異性和安全性。驗(yàn)證包括通過滴定同源肽抗原來評(píng)估TCR的親和力，以及測(cè)量一組對(duì)HLA－I匹配的腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用。如果沒有這樣的腫瘤細(xì)胞系存在，靶細(xì)胞可以轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)相關(guān)抗原和相關(guān)的HLA－I分子。新抗原也可以在自體抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)，以評(píng)估TCR的抗原反應(yīng)性。

安全性測(cè)試包括測(cè)試候選TCR－T對(duì)HLA－I匹配原發(fā)組織的識(shí)別能力，以確保沒有正常組織作為靶點(diǎn)，產(chǎn)生可能導(dǎo)致的非靶向毒性。在至少兩次TCR－T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)中，發(fā)生過對(duì)正常腦細(xì)胞和心臟細(xì)胞的交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致患者死亡。這些試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)調(diào)了TCR進(jìn)入臨床試驗(yàn)前進(jìn)行廣泛安全性試驗(yàn)的重要性。

TCR－T的安全性

TCR－T細(xì)胞的ACT顯示出很高的腫瘤殺傷，但在一些臨床研究中也出現(xiàn)了一些嚴(yán)重的不良事件。優(yōu)化工程化T細(xì)胞中的TCR親和力至關(guān)重要，受體親和力能夠決定T細(xì)胞治療的安全性和有效性。就療效而言，親和力TCR相互作用足以激活T細(xì)胞，但需要強(qiáng)親和力來維持T細(xì)胞的擴(kuò)增。

在I／II期ACT臨床試驗(yàn)中，低親和力工程化T細(xì)胞顯示出更安全的特性，但它們的抗腫瘤反應(yīng)較弱。通過識(shí)別T細(xì)胞的TCR－pMHC相互作用，可以將工程化T細(xì)胞分為高親和力型和低親和力型。此外，人們也開發(fā)了一些技術(shù)來提高TCR－T的安全性。

基于工程化T細(xì)胞的安全開關(guān)機(jī)制是一種有吸引力的策略。來源于單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV－TK）的胸苷激酶基因是最常見的自殺基因之一。

盡管HSV－TK在基于細(xì)胞的免疫治療中顯示出安全性，但需要導(dǎo)入磷酸化的核苷類似物。另一個(gè)更安全的誘導(dǎo)T細(xì)胞安全開關(guān)稱為誘導(dǎo)型caspase－9（iC9）。iC9是一種修飾的人FK結(jié)合蛋白，可通過小分子化合物AP1903激活，這一過程依賴于線粒體凋亡途徑。

iC9自殺基因的免疫原性較低，引發(fā)針對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的免疫反應(yīng)降低�；�于iC9的安全開關(guān)已經(jīng)被證明比先前的自殺基因更有潛力用于細(xì)胞治療。

TCR－T細(xì)胞治療的臨床現(xiàn)狀

截止2021年8月9日，在ClinicalTrials上共有175項(xiàng)使用TCR－T療法的研究正在進(jìn)行中，其中71項(xiàng)是針對(duì)特定TAA或新抗原的特異性TCR，有32項(xiàng)研究已經(jīng)完成。NY－ESO－1是最常見的靶向抗原，在多種癌癥中均有表達(dá)，包括骨髓瘤、黑色素瘤等。其他腫瘤睪丸相關(guān)抗原，如PRAME和MAGE蛋白，以及黑色素瘤分化抗原MART－1和gp100，以及最近的癌癥驅(qū)動(dòng)因子，如WT1、KRAS和TP53，也是流行的TCR－T靶點(diǎn)。                    

共有83名贊助者／合作者發(fā)起或參與TCR－T細(xì)胞治療的研究，包括美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）、政府組織、行業(yè)和大學(xué)／學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)。目前，美國國家癌癥研究所（NCI）共支持了53個(gè)TCR－T項(xiàng)目，占到了所有正在進(jìn)行項(xiàng)目的20％。

在開發(fā)TCR－T療法的29家制藥公司中，葛蘭素史克和Adaptimunime發(fā)起了最多的臨床試驗(yàn)，分別為11項(xiàng)和7項(xiàng)。最近，報(bào)道了一項(xiàng)針對(duì)人乳頭瘤病毒（HPV）－16 E7蛋白的TCR－T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性人乳頭瘤病毒相關(guān)上皮癌的1期臨床試驗(yàn)（NCT02858310）。在這項(xiàng)研究中，12名接受治療的患者中有6名出現(xiàn)了客觀的臨床反應(yīng)，觀察到了穩(wěn)健的腫瘤消退。這是TCR－T細(xì)胞療法的一個(gè)里程碑式的臨床試驗(yàn)，證明靶向病毒抗原對(duì)病毒相關(guān)癌癥患者具有良好的臨床效果。其他被探索為TCR靶點(diǎn)的病毒抗原包括HPV－E6蛋白、來自EB病毒（EBV）的抗原和人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（HERV）靶點(diǎn)，如HERV－E。

靶向TAAs 的MART－1和NY－ESO－1 TCR－T療法在晚期黑色素瘤、骨髓瘤和非小細(xì)胞肺癌中也顯示出臨床療效。完成的TCR－T臨床試驗(yàn)的總有效率（ORR）在0～60％之間。值得注意的是，這些TCR－T臨床試驗(yàn)中的大多數(shù)都只入組了少量患者（2至25名），因此ORR在統(tǒng)計(jì)上可能不太準(zhǔn)確。因此，需要更大規(guī)模的II期和III期臨床試驗(yàn)來確認(rèn)這些TCR－T療法的實(shí)際臨床療效。