FEP是什么？對(duì)小分子的藥物設(shè)計(jì)有什么幫助？FEP適合fast－follow／first－in－class的項(xiàng)目么？

在回答這些問題以前，我們先來糾正一個(gè)很多人會(huì)犯的一個(gè)錯(cuò)誤：

CADD（計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)）里的分子對(duì)接（docking）是藥物設(shè)計(jì)人員最常使用的功能。據(jù)我所知，有不少人會(huì)將計(jì)算結(jié)果的打分值（Scoring）作為分子好壞的標(biāo)準(zhǔn)。

下圖來源于薛定諤公司Dr． Jenny Chambers的《Introduction to Structure－Based Drug Design》。圖里說的很清楚，對(duì)接的打分結(jié)果和活性（IC50，Kd，EC50）無關(guān)，也不能用來對(duì)分子的好壞進(jìn)行排序，僅能作為富集分子的工具。

Docking因?yàn)槠浯蚍趾瘮?shù)不準(zhǔn)確以及采樣不足限制了這種方法的精度。有其他的CADD工具可以實(shí)現(xiàn)么？可以比較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)化合物的活性（結(jié)合自由能）？比如基于分子動(dòng)力學(xué)的MM／PB（GB）SA？

浙江大學(xué)藥學(xué)院的侯廷軍教授在這一領(lǐng)域研究多年，在最新的Review中（Chem． Rev． 2019， 119， 16， 9478–9508），侯教授認(rèn)為MM／PB（GB）SA在小分子藥物研發(fā)中的作用主要有兩類：①基于對(duì)接的虛擬篩選后的再評(píng)估②精確分析小分子－蛋白質(zhì)的相互作用。

關(guān)于MM／PB（GB）SA的預(yù)測(cè)精度，文章中是這么說的：

＂However， they cannot serve as a basis for developing more accurate methods and predict true drug candidates in drug design without experimental verification because of their relatively limited accuracy （compared with FEP and TI）．＂

這也和其他業(yè)內(nèi)專家的觀點(diǎn)一致，“對(duì)于MM／PB（GB）SA的預(yù)測(cè)能力是不做預(yù)期的”

那FEP和TI又是什么呢？

FEP：Free energy perturbation（自由能微擾）

TI：Thermodynamic integration（熱力學(xué)積分）

FEP、TI以及MM／PB（GB）SA都是常用的自由能計(jì)算方法，關(guān)于FEP／TI【自由能專題1：原理與方法】文章中是這樣介紹的：

自由能微擾法：Free Energy Perturbation （FEP） 和熱力學(xué)積分法：Thermodynamic Integration （TI）。這類方法從原理上來講比較嚴(yán)格，計(jì)算結(jié)果也較為準(zhǔn)確，但需要長時(shí)間的數(shù)據(jù)采集，對(duì)計(jì)算體系有嚴(yán)格的限制，只能適合較為簡單，而且這類方法一般只能計(jì)算兩個(gè)配體之間相對(duì)結(jié)合自由能，因此在以往的藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用受到了很大的限制，但是得益于近些年計(jì)算機(jī)性能的迅猛發(fā)展，由于這類方法計(jì)算的準(zhǔn)確度高，已成為藥物設(shè)計(jì)中的研究自由能的主流方法。

而兩者又有一定的差別：TI 是對(duì)FEP的模擬數(shù)據(jù)的另一種分析方法，分子動(dòng)力學(xué)模擬的軌跡和能量數(shù)據(jù)，經(jīng)過FEP或TI分析，計(jì)算出過程的自由能變。而 TI 的缺陷在于，其原理上難以分析通過REST2等增強(qiáng)采樣方法獲得的數(shù)據(jù)，因此限制了在結(jié)合模式復(fù)雜、口袋柔性大的復(fù)合物等場(chǎng)景的應(yīng)用。TI暫且不表。

FEP的理論基礎(chǔ)最早可以回溯到1930年代的Peierls的工作（Eur． Phys． J． A 1933， 80， 763?791），1954年，美國馬里蘭大學(xué)的理論物理學(xué)家和化學(xué)家Robert Zwanzig推導(dǎo)出了FEP的主方程：

自由能微擾（FEP）方法直到1980年代才引起計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）領(lǐng)域的關(guān)注：1986年，休斯頓大學(xué)的J． Andrew McCammon發(fā)表了題為“Dynamics and Design of Enzymes and Inhibitors”的文章（J． Am． Chem． Soc． 1986， 108， 13， 3830–3832），這代表著FEP方法在CADD領(lǐng)域首次應(yīng)用。1989年，加州大學(xué)舊金山分校的Peter Kollman教授首次進(jìn)行了FEP的前瞻性研究，對(duì)三肽類嗜熱菌蛋白酶抑制劑的活性進(jìn)行了預(yù)測(cè)（J． Am． Chem． Soc． 1989， 111， 15， 5649–5658）。

解釋下：關(guān)于FEP的回顧性研究（Retrospective study）和前瞻性研究（Prospective study）區(qū)別：回顧性研究是先有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，后再進(jìn)行FEP計(jì)算，是一種驗(yàn)證性的工作；前瞻性研究是先有FEP計(jì)算，后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，是一種預(yù)測(cè)性的工作。

隨后，F(xiàn)EP方法在學(xué)術(shù)界得到了進(jìn)一步的應(yīng)用，比如耶魯大學(xué)William L． Jorgensen教授在20世紀(jì)初開始，發(fā)表了多篇運(yùn)用FEP方法輔助Xa因子抑制劑／非核苷類HIV－1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑研發(fā)的文章。

不過，受制于力場(chǎng)的準(zhǔn)確性、采樣算法的效率以及算力，一直沒有在制藥工業(yè)界獲得廣泛的運(yùn)用。隨著力場(chǎng)、采樣算法、算力等方面的發(fā)展，薛定諤公司在2014年發(fā)布了商業(yè)化FEP計(jì)算工具FEP＋。

隨后薛定諤公司在2015年的JACS上發(fā)表了關(guān)于FEP計(jì)算預(yù)測(cè)親和力的重磅文章（J． Am． Chem． Soc． 2015， 137， 2695?2703），他們針對(duì)8個(gè)靶點(diǎn)／199個(gè)小分子配體的親和力進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并且和實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較，達(dá)到了非常高的相關(guān)性。下圖的虛線代表 1．0 kcal／mol的誤差，折算下來是5－10倍的IC50活性差距：這意味著FEP最終實(shí)現(xiàn)了藥物設(shè)計(jì)人員夢(mèng)寐以求的、化學(xué)精度的預(yù)測(cè)。

同時(shí)，文章中也對(duì)比了對(duì)接打分（Glide SP）和MM－GBSA預(yù)測(cè)的相關(guān)性，結(jié)果顯而易見。

再解釋下：或許很多人會(huì)疑惑結(jié)合自由能和活性（Ki，Kd，IC50）到底啥關(guān)系？【CADD ｜ 自由能微擾簡介】這篇文章給出了詳細(xì)的解釋，由于公式太過復(fù)雜，僅截取部分內(nèi)容，有興趣的閱讀全文哈。

關(guān)于自由能提升（kcal／mol）和活性改善相關(guān)性的詳細(xì)計(jì)算過程見圖，來源，B站：

隨著薛定諤上述文章的發(fā)表，可被工業(yè)界應(yīng)用的FEP技術(shù)引起了各大制藥公司的興趣，2016年的5月和8月，各大制藥公司進(jìn)行了多次的FEP研討會(huì)，并將討論的內(nèi)容和結(jié)論發(fā)表在期刊上（J Comput Aided Mol Des，2016， 30， 1139–1141）。

上述的制藥公司包括：默克／輝瑞／安進(jìn)／拜耳／強(qiáng)生／諾華／BMS／GSK／福泰

各大BigPharma不僅僅是感興趣，發(fā)現(xiàn)真的好用，可以加速研發(fā)之后，也逐漸將FEP作為重要的新藥研發(fā)工具，并發(fā)表了多篇有影響力的期刊文章。

比如，輝瑞的科學(xué)家利用FEP技術(shù)對(duì)17個(gè)不同五并六元雜環(huán)骨架的SYK抑制劑進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，得到了細(xì)胞活性提高10倍的化合物（ChemMedChem 2016， 11， 217 – 233）。

羅氏的科學(xué)家在JMC上發(fā)表了一篇很有意思的文章（J． Med． Chem． 2017， 60， 6， 2485–2497）。為了探索組織蛋白酶L的S2口袋，依據(jù)不同的伯胺共構(gòu)建了3325個(gè)分子的化合物庫。利用四種方法進(jìn)行篩選，分別是①FEP計(jì)算（FEP＋），②藥物化學(xué)家基于之前SAR進(jìn)行的挑選（MC，Med Chem），③專家通過結(jié)合模式以及相互作用的分析，進(jìn)行人工挑選（MM，SBDD），④基于MAB力場(chǎng)優(yōu)化的對(duì)接來預(yù)測(cè)的分子結(jié)合模式，再經(jīng)過人工挑選（DOMF，Docking）。

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測(cè)試之后的結(jié)果，下圖更直觀。和reference化合物相比，F(xiàn)EP篩選出來的化合物實(shí)驗(yàn)結(jié)果更好，10個(gè)化合物有8個(gè)超過reference，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他三種方法。

強(qiáng)生的科學(xué)家在進(jìn)行PDE2A抑制劑開發(fā)的hit－to－lead階段，利用FEP預(yù)測(cè)了265個(gè)設(shè)計(jì)的分子，并最終合成了100個(gè)化合物，經(jīng)過生物測(cè)試評(píng)估，得到了高活性、高選擇性、高BBB滲透、in vivo驗(yàn)證的先導(dǎo)化合物46（J． Med． Chem． 2020， 63， 21， 12887–12910）。

文章中，也對(duì)比了FEP和docking的效果，直接搬運(yùn)下：

＂FEP correctly identified 90％ （9 out of 10） of the 10 most active amongst its best ranked 10， compared to 20％ （2 out of 10） from docking．＂

阿斯利康的科學(xué)家在EED抑制劑的后期優(yōu)化階段，利用FEP對(duì)苯并二氫呋喃環(huán)上7位的R取代基（下圖）進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到了理化性質(zhì)／細(xì)胞活性提高的化合物（Bioorg． Med． Chem． Lett． 39 （2021） 127904）。

默克的科學(xué)家最近發(fā)表了非常重要的利用FEP加速研發(fā)的回顧性文章（J． Chem． Inf． Model． 2020， 60， 11， 5457–5474）。詳細(xì)的介紹參見【自由能方法及應(yīng)用（二）結(jié)合自由能計(jì)算在默克藥物研發(fā)實(shí)踐中的大規(guī)模前瞻性評(píng)估】。這里直接搬運(yùn)一下部分內(nèi)容：

“從2016年到2019年，作者前瞻性地將FEP＋應(yīng)用于12個(gè)靶點(diǎn)和23個(gè)化合物系列，進(jìn)行了超過35，000個(gè)獨(dú)立擾動(dòng)計(jì)算。最終，作者獲得了6，000多個(gè)化學(xué)實(shí)體的有效預(yù)測(cè)，合成和測(cè)試了400多個(gè)預(yù)測(cè)得到的新穎分子，產(chǎn)生了大量的前瞻性數(shù)據(jù)，提供了該方法在典型小分子藥物發(fā)現(xiàn)的實(shí)際流程中準(zhǔn)確性的詳細(xì)評(píng)估�！�

拜耳在2014年底就在內(nèi)部的研發(fā)中部署了FEP＋，截止2016年的數(shù)據(jù)，已有80％的項(xiàng)目、多達(dá)16個(gè)靶點(diǎn)使用了FEP，40％的化學(xué)家會(huì)經(jīng)常使用FEP計(jì)算（2016 Workshop on Free Energy Methods in Drug Design）。

葛蘭素史克的科學(xué)家同樣在2016年的workshop上披露了內(nèi)部使用FEP的情況。超過800個(gè)化合物進(jìn)行了FEP計(jì)算，下圖左則是8個(gè)項(xiàng)目251個(gè)化合物實(shí)驗(yàn)值／預(yù)測(cè)值擬合的情況，可以看到大部分化合物的預(yù)測(cè)還是相當(dāng)準(zhǔn)確的（2016 Workshop on Free Energy Methods in Drug Design）。

優(yōu)時(shí)比（UCB BioPharma）的Zara Sands博士在European Alchemical Free Energy Workshop 2019會(huì)議上介紹了優(yōu)時(shí)比內(nèi)部使用FEP的經(jīng)驗(yàn)和具體案例。

各大BigPharma已經(jīng)廣泛的、深入的使用FEP功能，F(xiàn)EP計(jì)算也已成為藥物研發(fā)必備工具之一了；那眾多的Biotech公司呢？

薛定諤就不用說了吧，作為最早推出商用化FEP工具“FEP＋”的Biotech，不僅發(fā)表了大量的高水平的FEP文章，加速了自由能計(jì)算領(lǐng)域的發(fā)展；并且在新藥項(xiàng)目中，早已把FEP＋運(yùn)用的爐火純青，并且陸續(xù)開發(fā)了諸如protein FEP，AL－FEP等研發(fā)利器。

很多Biotech公司（Nimbus、Agios、碩迪生物 etc）或者BigPharma（禮來、賽諾菲）和薛定諤合作的項(xiàng)目中，也借助了薛定諤的FEP＋等計(jì)算工具。

RAPT Therapeutics的科學(xué)家在FEP的幫助下，得到了高體外／體內(nèi)活性的USP7抑制劑（J． Med． Chem． 2020， 63， 5398?5420）。

Blueprint Medicines的Aysegul Ozen博士在Free Energy Workshop 2020上介紹使用FEP和protein FEP加速激酶抑制劑研發(fā)的具體案例，建議去Youtube上找來看看，非常棒的分享（Youtube搜索Aysegul Ozen）。

此外，Aysegul Ozen還介紹了他們驗(yàn)證和部署FEP的情況，目前已經(jīng)在內(nèi)部5個(gè)項(xiàng)目中成功應(yīng)用了FEP。

Silicon Therapeutics在STING抑制劑研發(fā)過程中，從近2萬個(gè)分子中，經(jīng)過相對(duì)自由能計(jì)算（FEP）預(yù)測(cè)，最終挑選了200個(gè)分子進(jìn)行合成，并最終獲得了臨床候選分子SNX281（Youtube，Physics－Driven Discovery of SNX281）；SNX281正在進(jìn)行和K藥聯(lián)用的抗腫瘤一期臨床研究。

Relay therapeutics則把自由能計(jì)算（FEP）作為Dynamo?平臺(tái)中Physics－based simulations的重要組成模塊。

那FEP到底能做什么？

自由能微擾（Free Energy Perturbation，F(xiàn)EP）計(jì)算可用來預(yù)測(cè)同系物的相對(duì)結(jié)合自由能變化。在FEP計(jì)算中，分子通過非物理（“煉金術(shù)”）途徑逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)上密切相關(guān)的類似物。通過對(duì)這些互相轉(zhuǎn)化的終態(tài)之間的自由能差（ΔΔG）的計(jì)算評(píng)估，可以獲得與實(shí)驗(yàn)值相比約1kcal／mol的預(yù)測(cè)精度。下圖即為相對(duì)自由能計(jì)算的熱力學(xué)循環(huán)圖，也是FEP計(jì)算重要的基本原理。

FEP的典型應(yīng)用場(chǎng)景有哪些？這里借用下薛定諤公司的Presentation。

簡單說，就兩類：①提升化合物的活性；②保持化合物活性的基礎(chǔ)上優(yōu)化其他成藥性質(zhì)。

所以，回到文章開始的問題，fast－follow／first－in－class的項(xiàng)目是非常適合用FEP的。

FEP算的到底準(zhǔn)不準(zhǔn)呢？

雖然已經(jīng)有眾多公司在使用FEP加速新藥研發(fā)了，但是我想很多人看到這里最大的疑問還是FEP算的準(zhǔn)不準(zhǔn)？

首先，F(xiàn)EP已是業(yè)界公認(rèn)的精度最高的計(jì)算結(jié)合自由能的方法，換句話說，就是目前預(yù)測(cè)活性最準(zhǔn)的方法了，已經(jīng)有非常多的研究文獻(xiàn)確證了這一點(diǎn)。

其次，F(xiàn)EP計(jì)算的精度受多種因素影響。

例如：強(qiáng)生的科學(xué)家在用FEP指導(dǎo)優(yōu)化BACE1抑制劑的過程中，發(fā)現(xiàn)FEP預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度和MD的模擬時(shí)長（1ns～20ns；2ns～40ns）密切相關(guān)（J． Chem． Theory Comput． 2017， 13， 1439?1453 ／ J． Chem． Inf． Model． 2016， 56， 9， 1856–1871）。

例如：強(qiáng)生的科學(xué)家們?cè)陂_發(fā)脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）抑制劑的過程中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象（J． Chem． Theory Comput． 2018， 14， 5815?5822）。抑制劑左右兩邊片段（下圖虛線方框）用FEP預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性是不一樣的，左邊共32個(gè)化合物，相關(guān)系數(shù)0．79；右邊共16個(gè)化合物，相關(guān)系數(shù)只有0．02。

例如：強(qiáng)生（對(duì)，還是強(qiáng)生）的科學(xué)家在優(yōu)化PDE2抑制劑的過程中，發(fā)現(xiàn)苯環(huán)／吡啶環(huán)上的取代基大小會(huì)影響蛋白質(zhì)中Leu770的朝向和水分子的有無（下圖），而晶體復(fù)合物中的這種細(xì)微差別對(duì)FEP計(jì)算的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性有非常大的影響（Sci Rep． 2018 20；8（1）：4883．）。

例如：力場(chǎng)的影響（Free Energy Workshop 2016）：

例如：復(fù)合物的影響（Alchemical Free Energy Workshop 2019）：

更多的影響因素討論，建議精讀上文提到的默克的科學(xué)家發(fā)表的利用FEP加速研發(fā)的回顧性文章（J． Chem． Inf． Model． 2020， 60， 11， 5457–5474）。

借業(yè)內(nèi)專家的觀點(diǎn)總結(jié)一下，影響FEP計(jì)算精度的因素有很多，主要可以分為2個(gè)方面的因素：

①算法和程序方面的因素：力場(chǎng)參數(shù)的準(zhǔn)確性，采樣算法的效率，perturbation scale的設(shè)計(jì)，?些極端情況下的特殊算法穩(wěn)定性，模擬時(shí)長等。

②使用者經(jīng)驗(yàn)方面的因素：復(fù)合物初始結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，Ligands變化的幅度，Ligands Alignment和Atom Mapping的合理性檢查，Perturbed Network的設(shè)計(jì)等。

關(guān)于算的準(zhǔn)不準(zhǔn)，再放張默克的圖吧（Workshop on Free Energy 2018）。圖片里的曲線是Gartner技術(shù)成熟度曲線，也可以說是關(guān)于認(rèn)知的達(dá)克效應(yīng)曲線。默克使用FEP兩年之后的summary可以這樣解讀：

Technology Trigger － 技術(shù)啟蒙 －－ 原來FEP代表的是這個(gè)意思，可以這樣用～

Peak of Inflated Expectations － 期望膨脹之巔 －－牛X，最準(zhǔn)的計(jì)算方法

Trough of Disillusionment － 質(zhì)疑、絕望之谷 －－ 在我的項(xiàng)目上預(yù)測(cè)的根本不準(zhǔn)啊，是不是騙人的啊～

Slope of Enlightenment － 開悟之坡 －－ 原來應(yīng)該這樣用，要這樣設(shè)置；果然，算的很準(zhǔn)～

Plateau of productivity － 加速研發(fā) －－ 所有合適的項(xiàng)目分子合成前，先用FEP算一把；開搞～

總之，F(xiàn)EP是個(gè)非常好的工具，但是也需要學(xué)習(xí)、實(shí)踐如何去用好它，發(fā)揮它的最大價(jià)值。

看到這里，也許你想試試FEP，那如何開始FEP計(jì)算呢？

（這里指前瞻性計(jì)算，理想情況下最好先做下回顧性計(jì)算）

簡單的說，你需要準(zhǔn)備

1． 含有小分子的某靶點(diǎn)共晶復(fù)合物（最好有，或經(jīng)過專家復(fù)核的高精度對(duì)接結(jié)果）。

2． 基于共晶復(fù)合物中小分子而設(shè)計(jì)的、結(jié)構(gòu)類似的新分子

然后就需要一款可以進(jìn)行FEP計(jì)算的專業(yè)軟件了，比如，商業(yè)化的軟件：薛定諤的FEP＋、Cresset的Flare V3；或者開源軟件，比如分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件Gromacs。

再或者， 你也許可以考慮下深勢(shì)科技的Uni－FEP

Uni－FEP能夠能夠兼顧C(jī)ADD專家及藥物化學(xué)的先導(dǎo)化合物優(yōu)化需求，提供：

1． 一站式自動(dòng)化的蛋白準(zhǔn)備、配體準(zhǔn)備、計(jì)算力場(chǎng)參數(shù)、分配電荷、弛豫與平衡體系的全自動(dòng)工作流的端對(duì)端服務(wù)，最小化用戶工作；

2． 更精確且適配的分子力場(chǎng)

3． 多種配體對(duì)齊方式

4． 自動(dòng)生成微擾圖，且微擾圖可自定義修改；

5． REST2增強(qiáng)采樣，提高精度與效率；

6． 基于 MBAR 統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算相對(duì)結(jié)合自由能

7． 計(jì)算結(jié)果的多種可視化、交互式分析

8． 可擴(kuò)展的計(jì)算資源

9． 相比FEP＋，更高的性價(jià)比；

10． 與Hermite其他功能組成完整的從靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)到苗頭化合物篩選，再到先導(dǎo)化合物優(yōu)化的整體解決方案；

11． 完善的售后服務(wù)及專家交流群

簡而言之，Uni－FEP作為為國內(nèi)最早公開發(fā)布測(cè)試的FEP計(jì)算模塊（可能也是國內(nèi)既“看”的到，也用的到、屈指可數(shù)的FEP產(chǎn)品），深勢(shì)科技團(tuán)隊(duì)在算法設(shè)計(jì)、動(dòng)力學(xué)引擎等方面儲(chǔ)備大量的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，尤其在前面提到的影響FEP計(jì)算精度的力場(chǎng)和采樣方面形成了比較顯著的技術(shù)壁壘，同時(shí)深勢(shì)科技的產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)對(duì)計(jì)算流程中大量的指令操作充分優(yōu)化，開發(fā)了易用簡潔的可視化界面，使其真正具備了“工業(yè)級(jí)”的工具能力。

國內(nèi)已經(jīng)有多家企業(yè)開始使用Uni－FEP：翰森、恩華、泓博、加科思，更多的合作企業(yè)即將披露～