大家好,今天糖葫蘆跟大家分享一篇的6+分的學(xué)習(xí)筆記。

題目:乳腺癌或頭頸癌放射敏感性預(yù)測(cè)因子的分子分析

一、研究背景

近一半的癌癥是單獨(dú)或聯(lián)合放射治療,放療除了對(duì)癌癥的治療作用外,不可避免地涉及到正常組織的暴露,其中晚期和急性不良反應(yīng)是治療的劑量限制因素。目前,還沒有可以可靠地預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)放射治療反應(yīng)的檢測(cè)方法。這篇學(xué)習(xí)筆記從血漿蛋白和單核苷酸多態(tài)性兩個(gè)角度尋找放射敏感性預(yù)測(cè)因子和預(yù)測(cè)模型。

二、分析流程

三、結(jié)果解讀1、樣本的篩選

血液樣本來自先前放射治療(RT)的乳腺癌(BC)和頭頸癌患者(HNC),采集血樣的時(shí)間點(diǎn)為完成 RT 后 1 至 8 年,他們對(duì)放射的敏感性(使用ICPL區(qū)分,RR:耐輻射;RS:輻射敏感)均已知:BC 患者 29 例(12 例 RR 和 17 例 RS),HNC 患者 74例(37 例 RR 和 37 例 RS)。

基于先前的實(shí)驗(yàn)研究、網(wǎng)絡(luò)分析工具以及其他文獻(xiàn)資料篩選出130個(gè)蛋白質(zhì),并且使用探索性親和蛋白組學(xué)挑選出259個(gè)抗體;通過文獻(xiàn)資料篩選出33個(gè)基因中的 55 個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。

在 BC 研究集中,沒有發(fā)現(xiàn)不完整或離群樣本。在 HNC 研究集中,由于技術(shù)原因,排除了兩個(gè)樣本,并在主成分分析(PCA)圖中發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)樣本存在一個(gè)具有不同蛋白質(zhì)組學(xué)特征的離群點(diǎn)。因此,最終確認(rèn)了100 個(gè)用于本次研究的樣本:BC 患者 29 例(12 例 RR 和 17 例 RS),HNC 患者 71 例(35 例 RR 和 36 例 RS)�；颊邔�(duì)輻射的敏感性狀態(tài)沒有不平衡。

2、正常組織和癌組織對(duì)輻射的應(yīng)答——研究蛋白

使用單因素分析篩選到8個(gè)在RR和RS患者之間存在顯著性差異的蛋白(Wilcoxon秩和分析p<0．05):STIM1, THPO, AKT1, IFNG, TPI1, DCXR, PNKD 和 FN1(圖1A、B)。

圖1．  Top候選者的蛋白質(zhì)譜 (A) STIM1 (B) THPO

使用logistic回歸篩選到額外的5個(gè)蛋白:SEPT7, ERCC1,IFNG , RAB5B 和 MBOAT7。同時(shí),logistic回歸顯示對(duì)輻射敏感性和年齡、性別以及癌癥的類型均無關(guān)。

由于單變量分析不能控制所選候選預(yù)測(cè)器的冗余(也就是說,由于獨(dú)立的、信息豐富的目標(biāo)蛋白數(shù)量有限,一組高相關(guān)的目標(biāo)蛋白可能具有較小的預(yù)測(cè)能力),因此作者通過計(jì)算候選蛋白之間的關(guān)系系數(shù)(圖2A),并比較了其與所有候選蛋白質(zhì)之間的成對(duì)相關(guān)系數(shù)的分布(圖 2B)。大多數(shù)候選蛋白質(zhì)譜呈正相關(guān)。其中在STIM1 和 AKT1(r=0．73>0．7)、IFNG 和 PNKD(r=0．73>0．7)之間存在最高的正相關(guān)關(guān)系(圖3D), MBOAT7 和 IFNG(r=-0．35)存在最高的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖3B)。

圖2． 候選蛋白之間相關(guān)性

圖3． 候選蛋白之間相關(guān)性

使用 KEGG 通路對(duì)入圍蛋白進(jìn)行功能注釋,結(jié)果顯示候選蛋白與癌癥信號(hào)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、代謝途徑和 DNA 修復(fù)這幾種生物學(xué)功能相關(guān)。

通過sandwich免疫分析驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的 RS 候選蛋白——THPO 和 STIM1。使用 THPO 的六種抗體和 STIM1 的五種抗體的組合。HNC 樣品的分析結(jié)果顯示:不同捕獲抗體對(duì)同一靶點(diǎn)的蛋白譜高度相關(guān)(圖 4A)。三種 STIM1 抗體 (HPA011018、HPA011088、HPA012123)和三種 THPO 抗體(HPA019596、HPA048828、HPA051629)顯示出顯著的一致性趨勢(shì)(圖 4B,C)。

圖4A．  STIM1和THPO抗體之間的相關(guān)性

圖4B、C．  使用sandwich免疫檢測(cè)來確定HNC樣本集中(B)STIM1和(C)THPO的趨勢(shì)

3、患者基因型及其與放射敏感性的關(guān)系

緊接著,對(duì)BC、HNC兩個(gè)樣本集中的33個(gè)基因的55個(gè)SNPs進(jìn)行分析。有 5 個(gè)SNP 位于 VEGFA (血管內(nèi)皮生長因子)區(qū)域。通過 TRRUSTv2 數(shù)據(jù)庫搜索 VEGFA 轉(zhuǎn)錄因子(TFs),作者發(fā)現(xiàn)了另外6 個(gè)SNPs:HIF1A(缺氧誘導(dǎo)因子)中含有5個(gè) SNP , TP53(17號(hào)染色體的基因,編碼一種抑癌蛋白)中含有1個(gè) SNP�？偟膩碚f,3個(gè)基因(VEGFA、HIF1A、TP53)的11個(gè)SNP分析結(jié)果表明:僅在rs699947不同基因型的患者中VEGFA具有顯著不同的等位基因頻率(p=0．048)(圖5)。因此,在基因型水平上,使用SNPs預(yù)測(cè)輻射敏感性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5． 不同基因型(AA-野生型、Aa-雜合子、AA-突變型)患者的VEGFA蛋白水平

4、 多蛋白模型預(yù)測(cè)放射敏感性

使用多重隨機(jī)驗(yàn)證(MRV)方法,根據(jù)抗體與 RS 狀態(tài)的相關(guān)性和重要性評(píng)分對(duì)抗體進(jìn)行排序。并使用“knee”方法來選擇最相關(guān)的抗體,從而選擇了 17 個(gè)抗體(圖6A)。與之對(duì)應(yīng)的的蛋白分別是:AKT1、FN1、PNKD、STIM1、THPO、BLVRB、CHIT1、DBNL、FGA(對(duì)應(yīng)2個(gè)抗體)、GCA、PDGFB、PGR、PPARA、RP2、SERPINC1 和 SLC4A1。

模型一:基于17個(gè)抗體;模型二:基于8個(gè)蛋白(CHIT1、PDGFB、PNKD、RP2、SERPINC1、SLC4A、STIM1、THPO 、PNKD和RP2);模型三:在模型二的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)SNP(rs699947)。對(duì)這三個(gè)模型進(jìn)行ROC曲線分析(圖6B),結(jié)果顯示模型一具有最好的診斷效能(區(qū)分RS和RR的能力),而模型二的診斷效能最差。

圖6A． 基于多重隨機(jī)驗(yàn)證(MRV)的抗體排序  圖6B． 三個(gè)模型的ROC曲線比較

計(jì)算各模型RS 預(yù)測(cè)因子的OR值。結(jié)果顯示:對(duì)于絕大多數(shù)模型中涉及的蛋白質(zhì)譜,蛋白質(zhì)水平的增加預(yù)示著患者作為 RS 的幾率更高(表1)。同時(shí),在模型 3 中觀察到顯著預(yù)測(cè)因子的比例最高,顯著預(yù)測(cè)因子包括CHIT1、PDGFB、PNKD、RP2、SERPINC1、SLC4A、STIM1 和 THPO 。

表1．  各模型RS 預(yù)測(cè)因子的OR值

使用邏輯回歸(LR)并根據(jù)閾值對(duì)各模型的分類性能做了總結(jié)。結(jié)果顯示:對(duì)于模型 1,觀察到 BC 和 HNC 患者的相似結(jié)果,而模型2和模型3 對(duì) HNC 患者的 RS 狀態(tài)預(yù)測(cè)更準(zhǔn)確。

表2．  各模型的邏輯回歸(LR)結(jié)果

小結(jié)

基于乳腺(n=29) 和頭頸部癌癥患者(n=74)樣本進(jìn)行兩組研究:對(duì) 33 個(gè)基因中的 55 個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進(jìn)行基因分型、通過基于親和力的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究130 循環(huán)蛋白。在這兩個(gè)研究集中,發(fā)現(xiàn)了幾種具有預(yù)測(cè)能力的血漿蛋白,并通過sandwich免疫分析驗(yàn)證了兩種最具預(yù)測(cè)能力的蛋白質(zhì)(THPO 和 STIM1)。通過將基因型和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)整合到分析模型中,作者發(fā)現(xiàn) CHIT1、PDGFB、PNKD、RP2、SERPINC1、SLC4A、STIM1 和 THPO 以及 VEGFA 基因變異體 rs69947 預(yù)測(cè)了乳腺癌(AUC=0．76)和頭頸部癌(AUC=0．89)患者的放射敏感性。點(diǎn)擊下方的閱讀原文,即可獲取學(xué)習(xí)筆記原文。