2．TIL、淋系和髓系評(píng)分相關(guān)的免疫細(xì)胞

MCP－counter是一種通過(guò)量化RNA測(cè)序結(jié)果來(lái)評(píng)估腫瘤中8個(gè)主要免疫細(xì)胞和2個(gè)基質(zhì)細(xì)胞群體豐度的方法。對(duì)上述細(xì)胞對(duì)應(yīng)的10個(gè)變量與TIL、淋系和髓系評(píng)分的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：除中性粒細(xì)胞以外，MCP－counter包含的所有免疫相關(guān)變量與TIL評(píng)分、淋系評(píng)分和髓系評(píng)分之間都有很強(qiáng)的相關(guān)性，而成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞與上述三種評(píng)分之間則未發(fā)現(xiàn)相關(guān)（圖2A）。

接下來(lái)，進(jìn)一步評(píng)估了TIL評(píng)分對(duì)淋系和髓系細(xì)胞在瘤床中豐度的代表能力。具體方式是運(yùn)用LASSO模型從MCP－counter的10個(gè)變量中選擇最佳的能夠預(yù)測(cè)TIL評(píng)分的變量。結(jié)果顯示在各種癌癥類型中，平均需要7個(gè)（范圍為5－10，圖2B）MCP－counter的變量來(lái)預(yù)測(cè)TIL，提示TIL能較好地描述腫瘤免疫的情況。為了進(jìn)一步深入探究，又用上述LASSO模型探究了不同癌癥類型中預(yù)測(cè)淋系和髓系評(píng)分所使用的MCP－counter中的變量情況（圖2C，D）。

在上述結(jié)果中，可以發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)癌癥類型中，預(yù)測(cè)TIL評(píng)分最重要的兩個(gè)變量是T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，而對(duì)于淋系評(píng)分的預(yù)測(cè)，最重要的變量是T細(xì)胞和B細(xì)胞，還有重要性稍低的NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞；對(duì)于髓系評(píng)分則是單核細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)表明TIL評(píng)分可以較好地代表TCGA泛癌隊(duì)列中T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞豐度，而淋系評(píng)分可以代表T細(xì)胞、B細(xì)胞以及較低程度上代表NK細(xì)胞豐度，髓系評(píng)分則是單核細(xì)胞豐度的良好指標(biāo)。

圖2A．TIL、淋系和髓系評(píng)分與MCP－counter中10個(gè)變量的相關(guān)分析；圖2B，C，D．使用LASSO模型基于MCP－counter預(yù)測(cè)TIL、淋系和髓系評(píng)分時(shí)使用的變量情況

3．TIL signature在泛癌TCGA隊(duì)列中的預(yù)后評(píng)估

接下來(lái)，對(duì)TIL評(píng)分以及淋系和髓系評(píng)分在TCGA泛癌隊(duì)列中預(yù)測(cè)預(yù)后的能力進(jìn)行評(píng)估，將它們與兩個(gè)作為黑色素瘤免疫檢查點(diǎn)阻斷療效預(yù)測(cè)的signature——IMPRES和IPS進(jìn)行了比較。IMPRES包括15對(duì)免疫檢查點(diǎn)基因，IPS則是效應(yīng)細(xì)胞，抑制細(xì)胞，主要組織相容性復(fù)合體（MHC）相關(guān)分子，檢查點(diǎn)／免疫調(diào)制劑四個(gè)評(píng)分的總和。將TIL、淋系和髓系評(píng)分視為連續(xù)變量，通過(guò)單變量Cox模型評(píng)估了這些變量預(yù)測(cè)總生存期（OS）和無(wú)進(jìn)展間隔（PFI）的能力（圖3A，B）。以對(duì)OS的預(yù)測(cè)作為參考基準(zhǔn)，TIL、淋系和髓系評(píng)分與IPS和IMPRES評(píng)分對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)能力以及預(yù)測(cè)結(jié)果都較為相似，但前三種評(píng)分對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的結(jié)腸癌具有顯著的更好的預(yù)測(cè)性能。以對(duì)PFI的預(yù)測(cè)作為參考基準(zhǔn)分析也觀察到了類似的結(jié)果。上述結(jié)果表明TIL，淋系和髓系三種評(píng)分可以提供與IMPRES和IPS相同以及互補(bǔ)的預(yù)后信息。

下一步，將TIL，淋系和髓系評(píng)分與IMPRES和IPS預(yù)測(cè)OS和PFI的時(shí)間依賴性ROC曲線的AUC進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)TIL、淋系和髓系評(píng)分的AUC非常接近，但在預(yù)測(cè)9種癌癥的OS以及10種癌癥的PFI時(shí)，它們的表現(xiàn)優(yōu)于IMPRES和IPS（圖3C，D）。為進(jìn)一步探討TIL對(duì)腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的貢獻(xiàn)，首先構(gòu)建包含年齡、性別、腫瘤類型和腫瘤分期的Cox模型，隨后又將基于基因signature的TIL評(píng)分和基于HE染色評(píng)估的TIL評(píng)分添加到模型中。以O(shè)S作為比較基準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)基于基因signature的TIL評(píng)分在9種癌癥類型中提高了預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，而基于HE染色的TIL評(píng)分沒(méi)有提高模型的精度。在類似的分析中，可發(fā)現(xiàn)淋系評(píng)分在6種癌癥類型中提高了預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，而基于HE染色的TIL評(píng)分依然沒(méi)有類似效果。這些數(shù)據(jù)共同說(shuō)明TIL評(píng)分是TCGA泛癌隊(duì)列中與OS和PFI相關(guān)的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，而且提示免疫腫瘤微環(huán)境的整體評(píng)估對(duì)患者的預(yù)后預(yù)測(cè)有重要作用。

圖3A，B．TIL、淋系和髓系評(píng)分以及IMPRES和IPS在不同癌癥類型中與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)；圖3C，D．TIL、淋系和髓系評(píng)分以及IMPRES和IPS預(yù)測(cè)不同癌癥類型患者預(yù)后的性能對(duì)比

4．用于預(yù)測(cè)對(duì)抗PD－1／PD－L1或CTLA－4反應(yīng)的TIL評(píng)分的評(píng)價(jià)

隨后，對(duì)TIL、淋系和髓系評(píng)分是否可以作為多個(gè)癌癥類型的PD－1／PD－L1抑制劑療效的生物標(biāo)志物進(jìn)行探究。為此參考了Yarchoan等人的meta分析——文章中總結(jié)了在幾個(gè)已發(fā)表的臨床試驗(yàn)中單獨(dú)使用PD－1／PD－L1抑制劑的客觀緩解率（ORR）。依據(jù)這些數(shù)據(jù)，評(píng)估了多個(gè)癌癥類型中TIL、淋系和髓系評(píng)分的中位數(shù)與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR之間的相關(guān)性（圖4A－C），觀察到TIL和淋系評(píng)分都與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR有關(guān)，淋系評(píng)分的相關(guān)系數(shù)略高于TIL評(píng)分；但髓系評(píng)分并未觀察到類似的相關(guān)。另外，還對(duì)經(jīng)典的生物標(biāo)志物腫瘤突變負(fù)荷（TMB）、擴(kuò)展免疫signature（EIG）和PD－L1（CD274）表達(dá)進(jìn)行了類似的分析，與預(yù)期一致，所有這些變量都與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR顯著相關(guān)。評(píng)估了TMB、EIG、PD－L1表達(dá)和淋系評(píng)分四者之間的相關(guān)情況，發(fā)現(xiàn)TMB與EIG，TMB與淋系評(píng)分之間都沒(méi)有關(guān)系，但EIG、PD－L1和淋系評(píng)分三者之間存在密切相關(guān)（圖4D）。

圖4A，B，C．不同癌癥類型的TIL、淋系和髓系評(píng)分與應(yīng)用抗PD－1／PD－L1療法后ORR的關(guān)聯(lián)；圖4D．TMB，ORR，CD274表達(dá)，淋系評(píng)分和EIG的相關(guān)分析

隨后進(jìn)行了包括TMB、EIG、PD－L1表達(dá)和淋系評(píng)分這幾個(gè)變量的多因素線性回歸，以得到預(yù)測(cè)ORR的最佳模型（表1）。使用AIC（一個(gè)反映統(tǒng)計(jì)模型擬合優(yōu)良性的指標(biāo)）作為參考，建立了TMB＋淋系評(píng)分的最佳模型。用ANOVA對(duì)單獨(dú)使用TMB和使用TMB＋淋系評(píng)分的模型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)淋系評(píng)分顯著改善了模型的預(yù)測(cè)性能（p＝0．05）。上述結(jié)果提示：?jiǎn)为?dú)使用淋系評(píng)分或者淋系評(píng)分＋PD－L1表達(dá)／TMB的模型有潛力作為簡(jiǎn)單而普適的預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效的方法。

表1．包含TMB、EIG、PDL1（CD274）表達(dá)和淋系評(píng)分的多因素線性回歸結(jié)果