化療、放療和外科手術(shù)是最傳統(tǒng)的癌癥治療方法，但它們的療效較低，副作用嚴(yán)重。因此，在過去的十年中，研究人員已經(jīng)開發(fā)了新的策略，從而實現(xiàn)疾病的完全緩解。目前，免疫療法已經(jīng)成為革命性的癌癥治療方法，有幾種類型的免疫療法用于治療癌癥，其中包括過繼細(xì)胞療法（ACT）。

嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法是一種ACT，自體T細(xì)胞通過基因工程表達(dá)CAR以特異性殺死腫瘤細(xì)胞。CAR－T細(xì)胞療法是治療對其他一線癌癥治療無反應(yīng)患者的一個機(jī)會，并且已經(jīng)在血液惡性腫瘤的治療中展現(xiàn)出優(yōu)越的抗腫瘤效果。然而，這類療法作為一線臨床治療仍有許多挑戰(zhàn)需要克服。從藥學(xué)的角度來看，這項新興技術(shù)仍然被歸類為先進(jìn)療法，因此，要應(yīng)用這項技術(shù)，必須首先滿足醫(yī)藥監(jiān)管的某些要求。因此，有必要分析CAR－T細(xì)胞技術(shù)的要素和挑戰(zhàn)，并將基礎(chǔ)、臨床和實踐等方面的因素考慮在內(nèi)，采取應(yīng)對策略，從而使CAR－T技術(shù)能夠成為可負(fù)擔(dān)的治療模式。

CAR－T細(xì)胞發(fā)展簡史

回顧C(jī)AR－T的發(fā)展史，首先要提到1957年Thomas及其同事報告的首次白血病患者骨髓移植以及隨后Miller等人發(fā)現(xiàn)了T細(xì)胞的起源。然而，直到1986年Steven Rosenberg報告了一項關(guān)于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）的研究，這才讓人們將目光鎖定在“患者自身的免疫細(xì)胞可以對抗自身癌癥”的理念上。

1992年，Sadelain等人成功地建立了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到T淋巴細(xì)胞的方法，使基因修飾成為在實驗或治療環(huán)境中控制免疫的手段。幾乎與此同時，ZeligEshhar及其同事利用抗體結(jié)合域和T細(xì)胞受體上免疫球蛋白的γ或ζ亞單位，通過嵌合單鏈設(shè)計了細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的特異性激活，從而開發(fā)出第一代CAR－T細(xì)胞。

五年后，Sadelain博士的研究小組證明，將CD28等共刺激信號整合到CAR－T中可增強(qiáng)生存、增殖并保持活性，從而開發(fā)出第二代CAR。隨后，攜帶靶向CD19的CAR－T細(xì)胞被開發(fā)出來，并啟動了慢性淋巴細(xì)胞白血�。–LL）和急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）的I期臨床試驗。試驗結(jié)果證明CAR－T療法在化療難治性ALL的成人中誘導(dǎo)有效緩解，隨后生物工藝生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大。

2017年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了CD19 CAR－T細(xì)胞療法（Tisagenlecleucel）適用于兒童和年輕人的ALL。到目前為止，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了五種用于癌癥治療的CAR－T細(xì)胞治療藥物。

CAR－T細(xì)胞治療的臨床挑戰(zhàn)

CAR－T細(xì)胞治療面臨的挑戰(zhàn)，主要與副作用、毒性、T細(xì)胞耗竭和惡性腫瘤微環(huán)境（TME）有關(guān)。此外，在大規(guī)模生產(chǎn)中的制造過程目前既耗時又昂貴，因此，使盡可能多的患者接受CAR－T細(xì)胞免疫治療成為一個更大的挑戰(zhàn)。

副作用和毒性

在CAR－T細(xì)胞輸注后，這種免疫療法可能具有潛在的致命毒性。據(jù)報道，一些副作用包括發(fā)熱、炎癥、肝酶異常升高、呼吸困難、發(fā)冷、思維混亂、頭暈、嚴(yán)重惡心、嘔吐和腹瀉。所有患者均有長期B細(xì)胞再生障礙，可通過服用丙種球蛋白緩解。毒性主要有兩類：細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性（NTX）或CAR－T細(xì)胞相關(guān)腦病綜合征（CRES）。

CRS或“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是一種全身炎癥反應(yīng)，由大量活化淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）以及髓系細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞）引起廣泛的臨床癥狀，包括發(fā)熱、疲勞、頭痛、皮疹、關(guān)節(jié)痛和肌痛。CRS是第一次輸注CAR－T細(xì)胞后幾天內(nèi)發(fā)生的最常見的不良反應(yīng)（85％的患者出現(xiàn)任何級別的CRS）。嚴(yán)重CRS病例以心動過速、低血壓、肺水腫、心功能不全、高熱、缺氧、腎損害、肝衰竭、凝血障礙和不可逆器官損害為特征。幸運的是，CRS的作用可以通過減少輸注T細(xì)胞的數(shù)量和／或通過服用抗IL－6受體單克隆抗體和類固醇來緩解。

NTX是CAR－T細(xì)胞免疫治療的另一常見并發(fā)癥，發(fā)生在40％以上的患者中。通常出現(xiàn)在CAR－T細(xì)胞輸注后的1至3周內(nèi)，通常與CRS相關(guān)。患者表現(xiàn)出各種癥狀，如困惑、遲鈍、震顫、譫妄、找詞困難和頭痛；其他癥狀，如失語癥、顱神經(jīng)異常和癲癇也有報道。

及時管理毒性對于降低與免疫治療相關(guān)的死亡率至關(guān)重要，因此，研究人員制定了不同的安全策略來克服和預(yù)防CAR－T細(xì)胞毒性，如設(shè)計新一代的CAR。毒性管理已成為CAR－T細(xì)胞免疫治療成功的關(guān)鍵步驟。

CAR－T細(xì)胞耗竭

盡管CAR－T細(xì)胞治療完全緩解率高，然而大部分獲得緩解的患者在幾年內(nèi)表現(xiàn)出疾病復(fù)發(fā)，B－ALL的復(fù)發(fā)率從21％到45％不等，并隨著隨訪時間的延長而增加。治療失敗的部分原因是實體瘤產(chǎn)生的TME導(dǎo)致的CAR－T細(xì)胞耗竭。

CAR－T細(xì)胞耗竭是指一種功能障礙狀態(tài)，其特征是由于持續(xù)的抗原刺激、CAR結(jié)構(gòu)的共刺激域和抑制性受體的表達(dá)增加而導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞的缺失。體外CAR－T細(xì)胞研究表明，在CAR－T細(xì)胞耗竭過程中，抑制性受體（如PD－1、Lag3、Tim3和TIGIT）的表達(dá)上調(diào)，以及通過CTLA－4抑制PI3K／AKT通路，是導(dǎo)致抗腫瘤功能喪失的主要原因。細(xì)胞因子在其中也起著重要作用，如耗竭的CAR－T細(xì)胞降低表達(dá)分泌IL－2、TNF－α和IFN－γ的能力此外。其他因素，如轉(zhuǎn)錄因子、代謝和表觀遺傳修飾，也在CAR－T細(xì)胞耗竭發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

延遲耗竭的一種可能方法是構(gòu)建抗耗竭的CAR－T細(xì)胞。最近的報告表明，某些轉(zhuǎn)錄因子如TOX和NR4A的發(fā)現(xiàn)，以及AP－1家族轉(zhuǎn)錄因子c－Jun的缺失或過度表達(dá)增加了CAR－T細(xì)胞對耗竭的抵抗力。最近，通過CAR－T細(xì)胞工程化（CRISPR／Cas9）敲除PD－1、或使用PD－1阻斷抗體已被用于提高CAR－T治療效果，避免耗竭。

腫瘤微環(huán)境

CAR T細(xì)胞免疫治療在實體瘤中尚未取得成功。一個可能的原因是TME的免疫抑制性質(zhì)影響過繼免疫治療的療效。實體瘤存在高度浸潤間質(zhì)細(xì)胞，如癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和抑制性免疫細(xì)胞，包括髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（TAN）、肥大細(xì)胞，和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），它們有助于建立一種免疫抑制性TME，能夠干擾CAR－T細(xì)胞療法的療效。

克服TME效應(yīng)的策略包括使T細(xì)胞能夠抵抗TME中的腫瘤抑制，例如顯性負(fù)性受體或信號轉(zhuǎn)換器的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，其可以將抑制信號轉(zhuǎn)化為刺激信號�？朔﨏AR－T細(xì)胞持續(xù)存在和耗竭的另一個機(jī)會是改善藥物向腫瘤部位的轉(zhuǎn)運。對于CAR－T細(xì)胞，局部注射是正在進(jìn)行的一種嘗試。

基因改變

一些報告顯示使用CAR－T細(xì)胞治療的患者缺乏療效和復(fù)發(fā)存在基因改變。Orlando等人整合了全外顯子組DNA－seq和RNA－seq，以研究CD19突變導(dǎo)致復(fù)發(fā)的程度。他們在12例患者樣本中均發(fā)現(xiàn)了CD19基因第2–5外顯子的新發(fā)基因改變，9例患者中的8例出現(xiàn)雜合性缺失，結(jié)論是CD19純合子突變是獲得性抗CAR－T細(xì)胞治療的主要原因。

Asnani等人報告了類似的發(fā)現(xiàn)，他們描述了CAR－T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)白血病患者外顯子2和外顯子5－6的跳躍。外顯子2對CAR－T CD19表位的完整性至關(guān)重要，而外顯子5－6負(fù)責(zé)CD19跨膜結(jié)構(gòu)域。然而，需要進(jìn)一步的研究來探索基因組分析的影響。

CAR－T細(xì)胞的制造工藝挑戰(zhàn)

制造CAR－T細(xì)胞的傳統(tǒng)技術(shù)包括：1）通過單采分離患者的T細(xì)胞（自體）；2）將回收的細(xì)胞運送到一個中心生產(chǎn)基地；3）對其進(jìn)行基因改造以表達(dá)CAR；4）在實驗室中進(jìn)行擴(kuò)增；5）將CAR－T細(xì)胞送回醫(yī)院，注入患者體內(nèi)。