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文章背景簡(jiǎn)介  

BACKGROUND INTRODUCTION

天冬酰胺連接（N－連接）蛋白糖基化是真核生物中最常見(jiàn)的翻譯后修飾之一，它影響著蛋白質(zhì)的特性，如折疊、穩(wěn)定性、免疫原性和藥代動(dòng)力學(xué)。附著在糖蛋白的N－聚糖可以參與生物過(guò)程，如免疫識(shí)別反應(yīng)和干細(xì)胞分化。而且，蛋白質(zhì)相關(guān)聚糖的改造工程可用于操縱蛋白相關(guān)的修復(fù)特性，如增強(qiáng)胞內(nèi)的活性和半衰期。

目前，聚糖固有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性、生產(chǎn)糖基化蛋白的潛在困難，限制了人們對(duì)糖蛋白功能的研究進(jìn)展。此外，由于聚糖的生物合成既不是模板驅(qū)動(dòng)的，也不是基因編碼的，因此聚糖不能通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。相反，N－聚糖是通過(guò)多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶在多個(gè)亞細(xì)胞室中的協(xié)調(diào)表達(dá)而自然產(chǎn)生的。這種生物合成模式加上缺乏嚴(yán)格的校對(duì)系統(tǒng)，導(dǎo)致了固有的聚糖異質(zhì)性，并造成了細(xì)胞或生物體所表達(dá)的聚糖庫(kù)中結(jié)構(gòu)的巨大多樣性。而更復(fù)雜的問(wèn)題是，糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系研究相對(duì)缺乏，這就是的聚糖結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其生物合成更加困難。

近年來(lái)，細(xì)菌糖工程這一研究方向的再次興起，使得生產(chǎn)設(shè)計(jì)聚糖和糖綴合物作為疫苗和治療方法逐漸成為可能。然而，由于細(xì)胞活力的限制和無(wú)法在體內(nèi)以精確的比例控制糖基化成分，基于細(xì)胞的糖蛋白生產(chǎn)困難重重。

目前，最具特征和最廣泛采用的無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（CFPS）系統(tǒng)是使用大腸桿菌裂解物來(lái)實(shí)現(xiàn)體外蛋白質(zhì)合成，但因?yàn)榇竽c桿菌缺乏內(nèi)源性糖基化機(jī)制，這些CFPS系統(tǒng)無(wú)法制造糖蛋白。

一些真核CFPS系統(tǒng)中可以進(jìn)行糖基化，包括昆蟲細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。然而，這僅限于進(jìn)行糖基化的內(nèi)源性機(jī)制。此外，真核生物的CFPS系統(tǒng)在技術(shù)上難以制備，通常需要補(bǔ)充微粒體，并且由于新生多肽鏈向微粒體的運(yùn)輸效率低下，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成和糖基化產(chǎn)量效率低下。

2018年美國(guó)西北大學(xué)的Thapakorn Jaroentomeechai在《Nature Communications》（中科院一區(qū)，IF＝14．919）發(fā)表題為“Single－pot glycoprotein biosynthesis using a cellfree transcription－translation system enriched with glycosylation machinery”的文章。這項(xiàng)工作研究了一種新的無(wú)細(xì)胞糖蛋白合成（CFGpS）技術(shù)，該技術(shù)無(wú)縫地將蛋白質(zhì)生物合成與天冬酰胺連接的蛋白糖基化相結(jié)合。該技術(shù)利用優(yōu)化了的富含糖鏈的大腸桿菌細(xì)胞提取物，選擇性地富集糖基化成分，包括寡糖轉(zhuǎn)移酶（OSTs）和脂聯(lián)寡糖（LLOs）。所得到的提取物可以進(jìn)行一鍋式的的高效反應(yīng)并且進(jìn)行位點(diǎn)特異性的糖基化。

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

基于大腸桿菌的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)具有開(kāi)放性，使得糖蛋白在CFPS的合成具有可能性。該小組最近的一項(xiàng)研究在基于大腸桿菌的CFPS中通過(guò)純化的糖基化組分實(shí)現(xiàn)了N－糖基化途徑，使大腸桿菌的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)具有合成糖蛋白的能力。

雖然這些結(jié)果建立了基于大腸桿菌提取物生產(chǎn)糖蛋白的可能性，但使用純化的糖基化成分存在幾個(gè)缺陷，限制了系統(tǒng)的效用。首先，糖基化成分的制備需要耗時(shí)且成本高昂的步驟，即純化多通道跨膜寡糖轉(zhuǎn)移酶和基于有機(jī)溶劑從細(xì)菌膜中提取脂聯(lián)寡糖供體。這些步驟大大延長(zhǎng)了工藝開(kāi)發(fā)時(shí)間，準(zhǔn)備LLO和OST組件各需要3－5天，需要熟練的操作人員和專業(yè)設(shè)備，導(dǎo)致產(chǎn)品必須冷藏，只能穩(wěn)定幾個(gè)月到一年。糖蛋白生產(chǎn)順序需要遵循先翻譯后糖基化這一策略，這需要20小時(shí)的靶蛋白合成，另外12小時(shí)的翻譯后蛋白糖基化。在這里，本文通過(guò)開(kāi)發(fā)一種集成的無(wú)細(xì)胞糖蛋白合成（CFGpS）技術(shù)來(lái)解決這些缺陷，該技術(shù)繞過(guò)了OSTs的純化和基于有機(jī)溶劑的LLOs提取的需要。這種流水型CFGpS系統(tǒng)的創(chuàng)建是由于兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)：（1）從優(yōu)化的大腸桿菌菌株CLM24中提取的粗提物能夠支持無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)和N－連糖基化；（2）從CLM24中提取的OST和富含LLO的提取物能夠重復(fù)地共激活蛋白質(zhì)合成和N－糖基化，該反應(yīng)混合物至少需要用編碼目標(biāo)糖蛋白的DNA啟動(dòng)。重要的是，CFGpS系統(tǒng)分離了糖蛋白合成成分（即OSTs、LLOs、翻譯機(jī)制）和感興趣的糖蛋白靶點(diǎn)的產(chǎn)生，與體內(nèi)系統(tǒng)相比，顯著降低了細(xì)胞活力的限制。最終的結(jié)果是獲得了一個(gè)一鍋式細(xì)菌糖蛋白生物合成平臺(tái)，通過(guò)這個(gè)平臺(tái)，不同的受體蛋白、OSTs或寡糖結(jié)構(gòu)可以在功能上進(jìn)行交換，并可為糖基化的形成定制原型。本研究建立的CFGpS將促進(jìn)糖科學(xué)的進(jìn)一步理解，并在糖蛋白的按需生物制造方面得以應(yīng)用。

       原文標(biāo)題 : 無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)+糖基化機(jī)制，實(shí)現(xiàn)“一鍋式”糖蛋白生物合成