01

文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

上個世紀(jì)，外源化學(xué)誘導(dǎo)劑和可溶性轉(zhuǎn)錄因子（TFs）在基因調(diào)控中的應(yīng)用是促進(jìn)生物技術(shù)和合成生物學(xué)快速發(fā)展的主要動力之一。然而，由于其可逆性有限、誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)運(yùn)基于擴(kuò)散，存在著潛在的脫靶效應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)延遲和毒性等多種缺陷。

光遺傳調(diào)控具有無創(chuàng)性、可逆性和高時空分辨率等優(yōu)點(diǎn)，有效突破了生化調(diào)控的限制。研究者將光遺傳工具應(yīng)用于真核細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控。 Yang等人開發(fā)了Lighton和Lightoff系統(tǒng)，報道了一個適用于釀酒酵母的只包含一個單體光敏蛋白LVAD的Ylighton系統(tǒng)。它是Lexa-VVD(LevI)和Gal4蛋白(Gal4AD)激活結(jié)構(gòu)域的融合， 以EL222為基礎(chǔ)構(gòu)建了釀酒酵母光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能產(chǎn)生8.49±0.31g/L異丁醇和2.38±0.06g/L 2-甲基-1丁醇。 Wu等人以EL222為基礎(chǔ)，構(gòu)建了斑馬魚光遺傳表達(dá)系統(tǒng)TaEL。Litoralis紅桿菌的光敏蛋白EL222是基于光誘導(dǎo)同二聚反應(yīng)的系統(tǒng)之一，由222個氨基酸(AA)組成。 EL222的N端為光氧電壓(LOV)結(jié)構(gòu)域，C端為螺旋轉(zhuǎn)螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)域。 當(dāng)EL222受到藍(lán)光照射時，黃素單核苷酸(FMN)與LOV的結(jié)合使Jα螺旋偏離LOV，從而釋放HTH，使EL222同二聚并與被稱為克隆1-20 bp(C120)的調(diào)控元件結(jié)合。在黑暗中，F(xiàn)MN與LOV解離。 LOV回到基態(tài)，抑制HTH與DNA的結(jié)合， EL222自發(fā)逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致EL222同聚物迅速解聚和失活。

作為真核生物，畢赤酵母（Pichia pastoris）具有真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)，如蛋白質(zhì)加工、折疊和翻譯后修飾等。與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有更快、更簡單、更便宜、表達(dá)水平更高的特點(diǎn)。然而，最常用的誘導(dǎo)劑甲醇具有劇毒和易燃的特性，在生產(chǎn)過程中我們很難對甲醇進(jìn)行監(jiān)測。因此，迫切需要探索一種新的調(diào)控方法。光遺傳調(diào)控可以有效地避免傳統(tǒng)化學(xué)誘導(dǎo)劑的缺點(diǎn)，是調(diào)控P.pastoris表達(dá)的良好方法。

華中科技大學(xué)Zhiqian Wang等人，開發(fā)了一個名為pBctrl的光開關(guān)基因表達(dá)系統(tǒng)用于P. pastoris基因工程表達(dá)。該系統(tǒng)包括一組專門設(shè)計用于匹配P. pastoris中的EL222的光調(diào)節(jié)啟動子。在定制啟動子的幫助下，藍(lán)光激活轉(zhuǎn)錄因子VP16-EL222在P. pastoris中起作用。最高感應(yīng)比達(dá)到79.7倍。此外，pBctrl系統(tǒng)被證明對基因表達(dá)具有可逆、快速、定量和時空控制。當(dāng)使用重組脂肪酶作為報告基因時，可以觀察到酶的活性和過表達(dá)。這種設(shè)計易于在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，并提供了一種新穎、快速、無污染的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)方法。2022年11月，他們在ACS Synthetic Biology期刊（生物2區(qū) IF 5.25）發(fā)表了“Design and Characterization of an Optogenetic System in Pichia pastoris”，文章詳細(xì)描述了該系統(tǒng)的設(shè)計、構(gòu)建和表征，并對其應(yīng)用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該研究為畢赤酵母中基因調(diào)控提供了一種新思路，具有重要的理論和應(yīng)用價值。

02

所用到的主要方法

METHODS   

1、PBCTRL的構(gòu)建 

2、倒置熒光顯微鏡觀察

3、共焦熒光成像

4、照明和光學(xué)測量

5、酶標(biāo)儀測量

6、流式細(xì)胞術(shù)

7、瓊脂平板顯像

8、脂肪酶活性定量測定

03

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT 

畢赤酵母（Pichia pastoris）是商品化生產(chǎn)許多有價值蛋白質(zhì)的主要宿主系統(tǒng)。傳統(tǒng)上，畢赤酵母中的基因表達(dá)調(diào)控是通過甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，但這種方法存在毒性和易燃性等問題。光遺傳技術(shù)提供了一種替代和更清潔的基因調(diào)控方法。本研究利用光敏蛋白EL222設(shè)計了一種新型“單組分”光遺傳系統(tǒng)，在藍(lán)光下誘導(dǎo)表達(dá)，最高誘導(dǎo)比為79.7倍。該系統(tǒng)具有簡單、高效、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，并且可以通過合理設(shè)計來進(jìn)一步改進(jìn)和擴(kuò)展其應(yīng)用。本研究為畢赤酵母中基因調(diào)控提供了一種新思路，具有重要的理論和應(yīng)用價值。

簡而言之，本文的主要研究內(nèi)容有：

1. 基于 el222的 gs115表達(dá)系統(tǒng)的設(shè)計

2. 藍(lán)光誘導(dǎo)單個細(xì)胞集落的激活

3. 劑量依賴性激活   

4. 在單細(xì)胞水平上評估性能

5. 光開關(guān)空間激活

6. pBctrl 系統(tǒng)的時間行為

7.   重組脂肪酶的表達(dá)

       原文標(biāo)題 : 一種畢赤酵母基因工程表達(dá)的光遺傳調(diào)控系統(tǒng)