5．在HPV + TIL中發(fā)現(xiàn)了生發(fā)中心B細(xì)胞

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TME中的B細(xì)胞與人類腫瘤類型的總體生存呈正相關(guān),并會(huì)影響CD4 + Tconv細(xì)胞表型。B細(xì)胞聚類顯示11個(gè)亞群(圖4A),基因集富集分析確定了:生發(fā)中心B細(xì)胞(#1-4)、漿細(xì)胞(#5)、幼稚細(xì)胞(#6和9),記憶細(xì)胞(#8和11)(圖4C)。細(xì)胞周期富集提示#3和4為暗區(qū)中迅速增殖的B細(xì)胞,而#1和2為亮區(qū)的中心細(xì)胞,在此處它們會(huì)受到CD4 + TFH的選擇。而在HPV–TIL中,僅存在于血漿或早期的B細(xì)胞(圖4B)可能與缺乏CD4 + TFH有關(guān)(圖3BE)。B細(xì)胞的擴(kuò)散映射圖(圖4DE)顯示了跨多軸分化的復(fù)雜過程,可以看到DC1與生發(fā)中心形成有關(guān),DC4與從幼稚到記憶B細(xì)胞的過渡有關(guān)以及DC3與向漿細(xì)胞的發(fā)育相關(guān),其中HPV–TIL和HPV+TIL在DC1上有顯著的差異,提示生發(fā)中心B細(xì)胞的顯著差異。生發(fā)中心B細(xì)胞存在于HPV+ HNSCC各個(gè)發(fā)展階段,而HPV–HNSCC中心B細(xì)胞較少,提示HPV + HNSCC可能有更好的預(yù)后。

圖4． B細(xì)胞分析揭示了生發(fā)中心B細(xì)胞和相關(guān)的獨(dú)特B細(xì)胞群體

6．共同的軌跡產(chǎn)生不同的髓系狀態(tài)譜

髓樣細(xì)胞有腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)和樹突狀細(xì)胞。TAM可以抗腫瘤的M1樣或促腫瘤的M2樣。最近研究表明TME中髓樣細(xì)胞之間存在更廣泛的異質(zhì)性,或可共同表達(dá)或獨(dú)特表達(dá)。這里確定了8個(gè)髓樣細(xì)胞亞群,其中#2-4主要存在于PBMC中,而#1和#5-8主要存在于TIL中(圖5AB)。

#2為CD16 +單核細(xì)胞,#3和4為CD14 +單核細(xì)胞(CD16+更成熟),且#3的FCGR3A(CD16)表達(dá)較低,表明它不是CD14 + CD16 +單核細(xì)胞的過渡亞群。#5和7則表達(dá)高水平的趨化因子和細(xì)胞因子。#1、6和8表達(dá)較高的HLA分子(與抗原呈遞細(xì)胞一致),但#1的IDO1,CCL17和CCR7表達(dá)較高;#6表達(dá)CD1C(與常規(guī)樹突狀細(xì)胞一致);#8高表達(dá)補(bǔ)體相關(guān)基因,以及M2相關(guān)基因。在HPV–TILs中發(fā)現(xiàn)有更多的#1和8,提示HPV–疾病患者具有潛在的免疫抑制作用。

接著進(jìn)行擴(kuò)散圖映射,并確定了幾個(gè)分支(圖5DE),#5位于中心,在DC1和DC2軸上的正方向上,#5朝#7和8發(fā)展,提示#7和8為終末分支(圖5EG)。已知補(bǔ)體高表達(dá)與未成熟的樹突狀細(xì)胞相關(guān),表明促進(jìn)#8這個(gè)樹突狀細(xì)胞亞群的成熟可以改善抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。(圖5G)

圖5． 髓系細(xì)胞在TME中的獨(dú)特狀態(tài)和潛在的可塑性

7．免疫細(xì)胞之間的crosstalk

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析不僅可以揭示細(xì)胞內(nèi)在信息,還可以通過配體和受體表達(dá)來探究可能的細(xì)胞外相互作用。為了找到潛在的細(xì)胞間相互作用,使用了708種配體和691種受體的list來鑒定配體/受體的表達(dá),這些配體/受體可以形成總共2557個(gè)潛在的相互作用對(duì)。首先評(píng)估了HPV–和HPV + HNSCC中差異表達(dá)的配體和受體(圖6AB)。接下來,為了挖掘更大的潛在配體和受體作用,使用自主開發(fā)的R包CellTalker(https://github．com/arc85/celltalker)鑒定免疫譜系內(nèi)部和譜系之間的相互作用�？偣茶b定了168個(gè)配體和194個(gè)受體,它們參與了481個(gè)獨(dú)特的相互作用,最后用circos圖進(jìn)行可視化(圖6C-6F)。交互大致分為三種類型:common、unique(與健康供體相比)、unique(與所有其他樣本相比)�？梢钥吹�,與健康人的PBMC和tonsil相比,TIL中的細(xì)胞通訊更多。

圖6．HPV–和HPV + TIL之間的受體和配體表達(dá)模式不同,并且在TIL中發(fā)生廣泛的細(xì)胞間通訊

8．空間組織與轉(zhuǎn)錄特征一致

盡管上一部分的分析從全局的角度揭示了細(xì)胞交互,但了解免疫細(xì)胞的空間定位將為基于鄰近性推測(cè)的細(xì)胞間通訊提供更嚴(yán)格的論證。所以接下來對(duì)同一患者的成對(duì)組織切片進(jìn)行了多光譜免疫熒光(IF)來探索免疫和腫瘤細(xì)胞的空間位置,并基于鄰近性確定了可能參與細(xì)胞間通訊的免疫亞群。

首先根據(jù)每種免疫細(xì)胞在亞群的頻率對(duì)每個(gè)感興趣區(qū)域(ROI)進(jìn)行分層聚類(圖7A),揭示了與特定免疫譜系相關(guān)的聚類。每張圖像中,使用R包trimesh進(jìn)行了Delunay三角剖分(Delunay triangulation,一種圖像處理技術(shù)),基于鄰近度來識(shí)別最可能彼此交互細(xì)胞類型。圖7B-7F右圖為一種細(xì)胞類型與另一種類型相互作用的對(duì)數(shù)比幾率。在B細(xì)胞頻率最高的#3和5中,B細(xì)胞相互作用幾率最高的是其他B細(xì)胞,其次是CD4 + Tconv(圖7D和7F)�；�于空間關(guān)系,接下來使用CellTalker來推斷HPV–和HPV + TIL中B細(xì)胞和CD4 + Tconv細(xì)胞之間交互網(wǎng)絡(luò)的差異(圖7G和7H)。與scRNA-seq和IF分析一致,發(fā)現(xiàn)HPV–和HPV + TILs中均有B細(xì)胞和CD4 + Tconv細(xì)胞的相互作用,但只有HPV + TIL的生發(fā)中心B細(xì)胞(cluster B-1至cluster B-4)與TFH(clusterCD4+ -1)之間有相互作用。

接下來,利用來自TCGA的臨床數(shù)據(jù)和bulk mRNA數(shù)據(jù)確定HNSCC中的CD4 + TFH是否與生存相關(guān)。與之前發(fā)表的數(shù)據(jù),HPV +患者的預(yù)后比HPV -好。然后,根據(jù)來自scRNA-seq數(shù)據(jù)中與TFH相關(guān)的差異表達(dá)基因評(píng)估了患者的TFH基因signature,并根據(jù)TFH評(píng)分進(jìn)行分層以進(jìn)行單變量PFS分析(圖7I)以及多變量生存分析,高TFH均與較好的預(yù)后顯著相關(guān)�？偟膩碚f,確定了不同組織切片的獨(dú)特免疫浸潤(rùn)模式,并使用CellTalker以及HPV +和HPV-HNSCC中的scRNA-seq數(shù)據(jù)表征了獨(dú)特的TFH亞群和生發(fā)中心的相互作用,并發(fā)現(xiàn)TFH富集的轉(zhuǎn)錄特征與更好的預(yù)后相關(guān)。

圖7． IF分析提供了基于空間定位的推定細(xì)胞間通訊信息

小結(jié)

本篇學(xué)習(xí)筆記利用scRNA測(cè)序評(píng)估了HPV–和HPV + HNSCC患者以及健康供體的外周和腫瘤內(nèi)免疫群體中131,224個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜,轉(zhuǎn)錄組結(jié)果通過多光譜免疫熒光分析和基于空間鄰近性來推測(cè)細(xì)胞交互來進(jìn)行背景分析。發(fā)現(xiàn)了HPV–和HPV + HNSCC免疫譜系之間的差異,這些結(jié)果對(duì)免疫療法的設(shè)計(jì)將產(chǎn)生重要的影響,相似的免疫譜系(CD8 + T之間和CD4 + Treg之間)靶向療法可能差異不大,而針對(duì)不同的免疫譜系(即CD4 + Tconv細(xì)胞,B細(xì)胞和髓樣細(xì)胞)的免疫療法則較為多變。

這篇學(xué)習(xí)筆記有很多亮點(diǎn),首先新開發(fā)的三種算法:DRAGON:基于熱學(xué)知識(shí)進(jìn)行聚類、SingleSetGset進(jìn)行基因集富集測(cè)試、CellTalker用于推斷細(xì)胞交互;其次是研究主題更有轉(zhuǎn)化意義,一般來說很多都是研究不同分子分型之間的差異,而這篇學(xué)習(xí)筆記著眼于病因差異研究,更容易在臨床上進(jìn)行判斷;然后研究?jī)?nèi)容比較豐富,不僅基于單細(xì)胞測(cè)序信息分析了特定免疫譜系的亞群狀態(tài),還分析了細(xì)胞間通訊和細(xì)胞鄰近性關(guān)系。最后是研究中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也很嚴(yán)謹(jǐn),不僅在鑒定差異基因用了事后功效分析,在細(xì)胞聚類也用其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證。在比較免疫譜系差異時(shí),也較新穎地使用了巴氏距離來量化差異。